胡立業(yè) 黃碧嬌 張煒 邵海華
摘 要 目的：分析核轉錄因子-κB（NF-κB）與小鼠肝臟脂肪變性、血清谷丙轉氨酶（ALT）水平的關(guān)系。方法：將20只小鼠隨機分為非酒精性脂肪肝組（高脂飲食飼養）和對照組（正常飼養），各10例。分別在10周、14周時(shí)測定ALT水平和NF-κB含量，觀(guān)察兩組肝組織病理形態(tài)。結果：非酒精性脂肪肝組干預10、14周時(shí)肝組織內NF-κB含量、血清ALT水平、白介素（IL）-6、IL-1β水平均高于對照組（P<0.05）。NF-κB含量與血清ALT水平呈正相關(guān)性（P<0.05）。結論：NF-κB含量增高，可導致小鼠肝臟脂肪變性，且與血清ALT水平呈正相關(guān)性。
關(guān)鍵詞 NF-κB 非酒精性脂肪肝 ALT 肝臟脂肪變性
中圖分類(lèi)號：R589.2；
R362 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2023）11-0056-03
引用本文 胡立業(yè)， 黃碧嬌， 張煒， 等. NF-κB含量與小鼠肝臟脂肪變性、血清ALT水平的關(guān)系研究[J]. 上海醫藥， 2023， 44（11）：
56-58；
66.
基金項目：江西省中醫藥科研項目（2019B077）
The relationship between NF-κB content and liver steatosis and serum ALT level in mice
HU Liye， HUANG Bijiao， ZHANG Wei， SHAO Haihua
（Department of Pharmacy， the Hospital affiliated to Jinggangshan University， Jian 343000， China）
ABSTRACT Objective：
To analyze the relationship between nuclear transcription factor-κB （NF-κB） and liver steatosis and serum alanine aminotransferase （ALT） level in mice. Methods：
Twenty mice were randomly divided into a non-alcoholic fatty liver group （fed on a high-fat diet） and a control group （fed on a normal diet）， with 10 cases each. Serum ALT levels and NF-κB content were determined at 10 and 14 weeks， and pathological morphology of liver tissues was observed in the two groups. Results：
The content of NF-κB in liver tissue， the serum ALT， interleukin-6， and IL-1β levels determined at 10 and 14 weeks of intervention in the non-alcoholic fatty liver group were all higher than those in the control group （P<0.05）. There was a positive correlation between NF-κB content and serum ALT level （P<0.05）. Conclusion：
The increase of NF-κB content can lead to steatosis in the liver of mice and has a positive correlation with serum ALT level.
KEY WORDS NF-κB；
non-alcoholic steatohepatitis；
ALT；
hepatic steatosis
非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFL）是危害全球人類(lèi)健康的常見(jiàn)慢性肝臟疾病，其病理特征是非酒精性因素導致肝細胞內脂肪變性，是諸多代謝性疾病的危險因素[1]。若干預不及時(shí)，隨著(zhù)疾病的不斷進(jìn)展，可逐漸發(fā)展至脂肪性肝炎、肝纖維化以及肝癌，威脅到患者的生命安全[2]。核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor，NF-κB）主要分布在脂肪組織中，參與了多種基因的轉錄，調控多種細胞因子、黏附分子及趨化因子的表達，并與脂肪代謝過(guò)程、炎癥反應密切相關(guān)[3]。谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase， ALT）主要分布在肝細胞胞漿內，正常時(shí)僅有少量釋放入血，在病毒性肝炎急性期或肝細胞壞死時(shí)，ALT大量釋放入血，是診斷肝臟疾病的重要標志物[4]。因此，明確NAFL的發(fā)病機制，提高臨床治療特異性顯得極其重要。本研究擬在小鼠模型中分析NF-κB含量與小鼠肝臟脂肪變性、血清ALT水平的關(guān)系，旨在為臨床病理研究提供參考。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗動(dòng)物
20只雄性小鼠（C57BL/6），4周齡，SPF級，購于北京維尚利德公司，并在動(dòng)物中心清潔級屏障系統飼養（井岡山大學(xué)醫學(xué)部實(shí)驗室提供），體質(zhì)量12～16 g。飼養環(huán)境：（20±2）℃、空氣濕度（50±5）%，自由進(jìn)食，晝夜均衡。
1.2 儀器和試劑
Avanti J-30I型高速低溫離心機（Beckman Coulter公司）；
DR-200B參比式8通道酶聯(lián)免疫檢測儀（無(wú)錫華衛德朗儀器有限公司）；
BS620全自動(dòng)生化分析儀（深圳邁瑞公司）；
胎牛血清（AusGenex P1Y LTD，批號FBS500-S）；
RPMI-1640培養基（Gibco公司）；
兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體（上海博谷生物科技有限公司）；
酶聯(lián)試劑盒及配套試劑均購自武漢博士德生物工程公司。
1.3 方法
1.3.1 分組及建模
將20只雄性小鼠隨機分為對照組（n=10），給予普通飲食正常喂養；
NAFL組（n=10），高脂飲食喂養，建立非NAFL小鼠模型，高脂飲食配比：膽固醇占2%、膽酸鈉占0.5%、蔗糖占5%、丙硫氧嘧啶占0.2%、豬油占10%、基礎飼料占82.3%。兩組小鼠均自由飲水。在喂養后10、14周分別處死小鼠各5只，處死前經(jīng)股動(dòng)脈采集血液，取出肝臟組織，置于﹣80 ℃冰箱內保存。
1.3.2 肝組織病理檢查
留取的肝臟組織用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察切片病理形態(tài)。輕、中、重度脂肪肝分級分別為低倍鏡下見(jiàn)肝臟細胞脂肪變性范圍占肝小葉的1/3、1/3～2/3、2/3以上。
1.3.3 NF-κB測定
取肝臟組織100 mg，剪碎，添加苯甲基磺酰氟（PMSF）裂解液1 mL，冰上勻漿幾秒后，12 000 r/min離心10 min。留取上層清液，應用雙抗體夾心法，按照試劑說(shuō)明書(shū)[5]操作。在孵育過(guò)程中注意避光，用酶聯(lián)免疫檢測儀于波長(cháng)450 nm測定OD值，并計算NF-κB含量。
1.3.4 血清ALT水平測定
小鼠處死前，禁食不禁水，無(wú)抗凝真空采血管采集股動(dòng)脈血液，常溫下于3 000 r/min離心10 min分離血清，置入﹣80 ℃冰箱內保存待檢，采用全自動(dòng)生化分析儀測定血清ALT水平。
1.3.5 血清炎癥水平測定
將分離的血清用ELISA測定小鼠血清白介素-6（IL-6）、IL-1b表達，采用雙抗夾心法，嚴格按照說(shuō)明書(shū)操作，步驟同NF-κB含量檢測方法。
1.4 統計學(xué)方法
采用SPSS 20.0統計學(xué)軟件，計量資料用x±s表示，采取t檢驗；
計數資料以百分比率（%）表示，采取χ2檢驗。采用Pearson相關(guān)法分析兩指標之間的相關(guān)性。P<0.05提示差異有統計學(xué)意義。
2 結果
2.1 肝組織病理
整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中，小鼠飲食飲水正常，皮膚完整，大便成形，精神活躍。對照組小鼠肝小葉結構完整、肝索排列整齊，肝細胞無(wú)腫脹、無(wú)異常，無(wú)炎性細胞浸潤及肝臟脂肪變性。NAFL組，干預10周時(shí)的小鼠肝臟脂肪變性明顯，占全部視野的50%以上；
干預14周時(shí)肝臟脂肪變性占全部視野的80%以上，肝臟細胞均變大、變圓，部分肝臟細胞內見(jiàn)巨大脂肪滴、炎性細胞浸潤。
2.2 NF-κB含量
NAFL組干預10、14周時(shí)，肝組織內NF-κB含量（n=5）隨著(zhù)時(shí)間延長(cháng)而增加，且高于對照組（P<0.05，圖1）。
2.3 血清ALT水平
NAFL組干預10、14周時(shí)檢測，結果顯示，血清ALT水平隨著(zhù)時(shí)間延長(cháng)而增加，且高于對照組（P<0.05，表1）。
2.4 血清炎癥水平
NAFL組干預10、14周時(shí)，血清IL-6、IL-1b水平均高于對照組（P<0.05，表2）。
2.5 相關(guān)性分析
經(jīng)Pearson相關(guān)法分析，NF-κB含量與血清ALT水平呈正相關(guān)性（r=0.826，P<0.05）。
3 討論
NAFL發(fā)病機制尚未明確，多認為是因各種原因導致脂質(zhì)代謝紊亂，肝細胞內大量脂肪沉積，導致肝臟脂肪變性，造成肝臟炎癥壞死或肝臟纖維化[6]。本研究發(fā)現非酒精性脂肪肝主要病理特點(diǎn)是肝臟細胞脂肪變性，肝臟細胞內見(jiàn)炎性細胞浸潤。故證實(shí)了脂肪沉積、脂質(zhì)代謝紊亂是致NAFL發(fā)生的主要原因，由于脂肪組織是細胞因子的重要來(lái)源，肝臟細胞脂肪變性會(huì )導致巨噬細胞浸潤，促進(jìn)多種炎性細胞因子的釋放，以此加重肝臟組織脂肪變性程度[7]。
有研究表明NAFL的發(fā)生、發(fā)展與“多重打擊”學(xué)說(shuō)中的氧化應激、炎癥反應、脂質(zhì)過(guò)氧化等多種病理機制有關(guān)[8]。其中NF-κB是細胞內重要的核轉錄因子，它參與了機體的炎癥反應、免疫應答，能調節細胞凋亡、應激反應。本研究結果表明模型小鼠建立后，隨著(zhù)高脂飲食時(shí)間的延長(cháng)，使NF-κB含量明顯增加，NF-κB含量越高，肝臟組織損傷越嚴重，且血清ALT水平越高。熊建團等[9]研究發(fā)現，TLR4/NF-κB信號通路直接在非酒精性脂肪性肝病的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，且NF-κB含量明顯升高，說(shuō)明NF-κB信號通路參與了肝臟病變的發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程。主要原因是NF-κB是一種被炎癥因子與反應性氧介導物激活的轉錄因子，當NF-κB活化過(guò)度，會(huì )增加脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的沉積，促使大量炎癥因子釋放，加劇巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞活性，繼而加重肝臟炎癥反應，另外大量炎癥介質(zhì)反作用于NF-κB，進(jìn)一步增加NF-κB活性，兩者循環(huán)加劇，最終導致肝臟纖維化，誘發(fā)肝臟病理狀態(tài)[10-11]。
基于NF-κB信號通路與炎癥因子之間的關(guān)系，本研究顯示，非酒精性脂肪肝組的炎癥反應明顯升高。許俊等[12]研究發(fā)現，IL-18通過(guò)激活NF-κB通路調控各種炎癥因子而誘發(fā)膽汁淤積。董文娟等[13]研究指出，降脂瘦身湯通過(guò)下調NF-κB活性而能降低非酒精性脂肪肝大鼠的血脂水平，從而減輕肝臟病理?yè)p傷，說(shuō)明NF-κB激活會(huì )釋放大量的炎癥因子，使體內血清炎癥表達升高。分析原因可能是NF-κB信號通路通過(guò)調節各種炎性因子影響肝臟纖維化，其異常激活會(huì )導致機體免疫、炎癥等相關(guān)基因表達異常，激活炎癥反應會(huì )加重肝臟組織損傷；
同時(shí)通過(guò)組織損傷暴露的大量?jì)仍葱訲LR4配體而誘導TLR4表達及活化，加劇脂肪代謝及胰島素抵抗，使肝臟組織損傷加重，使血清ALT水平升高。
綜合本研究發(fā)現，NF-κB活性增強與小鼠肝臟脂肪變性密切相關(guān)：NF-κB活性升高，肝組織損害越明顯，證實(shí)NF-κB在肝臟組織脂肪變性中起著(zhù)重要作用。其作用機制可能是NF-κB的過(guò)度激活誘發(fā)機體炎癥反應，加劇脂肪代謝及胰島素抵抗，從而導致肝臟組織損傷加重。但肝臟脂肪變性過(guò)程復雜，且研究缺少對NF-κB信號通路的靶向基因研究，通過(guò)對NF-κB信號通路的靶向治療，能否延緩肝臟脂肪變性有待進(jìn)一步研究證實(shí)。
參考文獻
[1] 黃華清， 向愛(ài)民， 賴(lài)大行， 等. 利拉魯肽對2型糖尿病非酒精性脂肪肝的治療作用及可能機制研究[J]. 江西醫藥， 2020， 55（4）：
382-385；
389.
[2] Manne V， Handa P， Kowdley KV. Pathophysiology of nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis[J]. Clin Liver Dis， 2018， 22（1）：
23-37.
[3] 胡波， 徐穎， 丁輝， 等. 葛根素通過(guò)抑制IκBα/NF-κB p65信號軸緩解大鼠非酒精性脂肪肝損傷[J]. 廣州中醫藥大學(xué)學(xué)報， 2021， 38（2）：
366-372.
[4] 桑夢(mèng)珠， 吳克儉， 李平靜， 等. 非酒精性脂肪肝患者的ALT水平及其影響因素和應用價(jià)值分析[J]. 醫學(xué)研究雜志， 2021， 50（4）：
99-105.
[5] 楊清武. 一種以酶聯(lián)免疫方式檢測核轉錄因子活性的方法：
中國， CN1477399A[P]. 2004.
[6] Anania C， Perla FM， Olivero F， et al. Mediterranean diet and nonalcoholic fatty liver disease[J]. World J Gastroenterol， 2018， 24（19）：
2083-2094.
[7] 倪斌， 易成， 張理科. 基于抗炎及抗氧化作用探討微生態(tài)制劑在非酒精性脂肪肝模型大鼠中的應用價(jià)值[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志， 2020， 32（5）：
533-536.
[8] Wang Q， Ou Y， Hu G， et al. Naringenin attenuates nonalcoholic fatty liver disease by down-regulating the NLRP3/ NF-κB pathway in mice[J]. Br J Pharmacol， 2020， 177（8）：
1806-1821.
[9] 熊建團， 顧鈴毓， 王青青， 等. TLR4/NF-κB信號通路對CBS+/-小鼠非酒精性脂肪性肝病的影響[J]. 中國病理生理雜志， 2021， 37（7）：
1227-1232.
[10] 姜云， 吳大強， 馬克龍， 等. 丹皮酚對非酒精性脂肪肝大鼠炎癥因子表達的影響[J]. 中藥新藥與臨床藥理， 2019， 30（2）：
189-193.
[11] 何峰， 張雪蓮， 溫祥臣. 山楂酸對高脂飲食誘導的非酒精性脂肪肝模型小鼠炎癥反應及氧化應激的影響[J]. 中國藥房， 2019， 30（7）：
901-905.
[12] 許俊， 劉少志， 王穎， 等. IL-18通過(guò)NF-κB通路調控MRP3對ANIT引起的膽汁淤積模型的影響及其機制[J].現代消化及介入診療， 2020， 25（5）：
613-617；
623.
[13] 董文娟， 楊立宏， 張文佳. 降脂瘦身湯對非酒精性脂肪肝大鼠脂代謝及核轉錄因子-κB蛋白表達影響的實(shí)驗研究[J]. 陜西中醫， 2021， 42（8）：
1016-1019.
