血紅蛋白氧載體聯(lián)合依達拉奉局部預灌注對急性腦梗死模型大鼠神經(jīng)元的保護作用及機制*

周正龍, 胡俞成, 韓潤敏, 彭瀚, 楊華, 向欣*

(1.貴州醫科大學(xué)附屬醫院 神經(jīng)外科, 貴州 貴陽(yáng) 550004; 2.濟源市中醫院 神經(jīng)外科, 河南 濟源 459000)

急性腦梗死(acute cerebral infarction, ACI)是較為常見(jiàn)的一種急性腦血管疾病,具有較高的臨床病發(fā)率及致殘致死率［1-2］。ACI起病急、治療時(shí)間窗短,關(guān)鍵在于盡早開(kāi)通閉塞血管以使缺血腦區獲得有效灌注［3-5］。血紅蛋白氧載體(hemoglobin oxygen carrier,HBOC)是運輸和傳遞氧分子的小分子物質(zhì),具有恢復缺血組織供氧的能力,為缺血組織供應、轉運氧橋,以增加缺血腦組織的氧供,對于缺血性腦血管疾病預后的改善具有顯著(zhù)意義［6-8］。依達拉奉(edaravone,EDA)是一種常用于A(yíng)CI的自由基清除劑,其分子質(zhì)量低、容易穿透血腦屏障,具有消除神經(jīng)細胞水腫、促進(jìn)炎癥吸收、減輕炎性反應等神經(jīng)保護作用的能力［9-11］。有研究發(fā)現,聯(lián)合用藥能更好地應對ACI腦缺血后的級聯(lián)反應,是ACI治療的研究熱點(diǎn)［12-14］。推測在HBOC與EDA聯(lián)合治療ACI的過(guò)程中,可能會(huì )表現出較單一藥物治療方案更明顯的協(xié)同保護作用,其涉及的保護機制也可能會(huì )更加多元化。因此,本研究結合HBOC與EDA的網(wǎng)絡(luò )藥理學(xué)和生物學(xué)驗證,探討二者聯(lián)合治療對ACI的神經(jīng)保護作用及可能機制,為ACI灌注治療方法提供新思路。

1.1 實(shí)驗材料

1.1.1動(dòng)物來(lái)源 清潔級雄性成年SD大鼠120只,8～12周齡,體質(zhì)量250～300 g,由貴州醫科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗中心提供［SYXK(黔)2018-0001］,研究獲得貴州醫科大學(xué)倫理委員會(huì )批準(1600286)。實(shí)驗過(guò)程中大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水,實(shí)驗室溫度21～23 ℃,濕度40%～60%。

1.1.2主要儀器與試劑 微量注射泵購自宿州百意醫療器械有限公司,生物組織自動(dòng)組織脫水機購自武漢俊杰電子有限公司,流式細胞儀購自美國B(niǎo)D Bioscience公司,SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司,一步法快速Western blot試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 (Caspase-3)、缺氧誘導因子-1α (HIF-1α)、白細胞介素-6 (IL-6)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自北京康為世紀生物科技有限公司;HBOC-201購自北京潤方生物醫藥研究有限公司,EDA注射液購自南京先聲東元制藥有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1網(wǎng)絡(luò )藥理分析數據庫及軟件 PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),PharmMapper數據庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/),Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/),OMIM數據庫(https://omim.org/),Genecards數據庫(https://www.genecards.org/),David數據庫(https://david.ncifcrf.gov/),STRING數據庫(https://string-db.org/),Venny2.1在線(xiàn)軟件作圖工具平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/ tools/ venny/),Uniprot數據庫(https:// www.uniprot.org/),Cytoscape3.9.1軟件,R4.2.1軟件等。

1.2.2藥物及疾病靶點(diǎn)篩選 在NCBI的PubChem數據庫中檢索HBOC及EDA的基本信息,使用PharmMapper數據庫和Swiss Target Prediction數據庫獲取靶點(diǎn),經(jīng)uniprot數據庫對靶點(diǎn)名稱(chēng)矯正統一、去除重復靶點(diǎn),分別獲得HBOC及EDA對應靶點(diǎn);使用OMIM、GeneCards數據庫以“acute cerebral infarction”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,去除重復靶點(diǎn)后獲得ACI對應靶點(diǎn)。

1.2.3共同靶點(diǎn)的篩選及“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò )的構建 在Venny2.1在線(xiàn)軟件作圖工具平臺上輸入藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn),將獲得的HBOC、EDA和ACI的靶點(diǎn)相交,繪制維恩圖提取共同靶點(diǎn);將共同靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.9.1軟件中,繪制出“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò )圖。

1.2.4基因通路和功能分析 將預測的共同靶點(diǎn)導入DAVID數據庫,采用GO富集分析及KEGG通路富集分析HBOC聯(lián)合EDA治療ACI中的生物過(guò)程及信號通路,設置P<0.05為篩選條件,選擇排名靠前的生物過(guò)程及信號通路,使用R語(yǔ)言對富集結果進(jìn)行可視化,繪制條形圖與氣泡圖。

1.2.5“藥物-靶點(diǎn)-疾病-關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡(luò )的構建與核心靶點(diǎn)的獲得 選擇P值最小的前4個(gè)通路的氣泡圖,在Cytoscape 3.9.1軟件中構建“藥物-靶點(diǎn)-疾病-關(guān)鍵通路”的網(wǎng)絡(luò )圖并進(jìn)行可視化分析;將關(guān)鍵通路的對應靶點(diǎn)導入STRING數據庫,將物種設置為“Homo sapiens”,檢索蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系,設置最低的相互作用閾值(中等置信度=0.4),其他參數保持在默認值;結果被保存為T(mén)SV文件后,導入到Cytoscape 3.9.1軟件中,將節點(diǎn)的大小和顏色與程度相關(guān),并將邊緣的厚度與聯(lián)合評分相關(guān),繪制出蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò )(protein-protein interaction networks,PPI),篩選核心靶點(diǎn)。

1.2.6實(shí)驗動(dòng)物模型的制備及分組 將大鼠按隨機數字表法分為假手術(shù)組、模型組、HBOC治療組、EDA治療組、HBOC聯(lián)合EDA治療組(聯(lián)合治療組),每組24只。按參考文獻［15］方法建立大鼠大腦中動(dòng)脈梗死(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,建模3 h后,采用微量注射泵將生理鹽水(6 mL/kg)、HBOC(6 mL/kg)、EDA注射液(1.5 mL/kg)、或HBOC(6 mL/kg)和EDA注射液(1.5 mL/kg)聯(lián)合經(jīng)微導管分別持續泵入模型組、HBOC治療組、EDA治療組、聯(lián)合治療組大鼠頸外動(dòng)脈遠端,除假手術(shù)組外其余各組大鼠繼續梗死1 h后取出線(xiàn)栓,恢復血流進(jìn)行再灌注;而假手術(shù)組僅分離大鼠動(dòng)脈,不插入線(xiàn)栓,即僅給予麻醉及頸正中切口,然后縫合。

1.2.7神經(jīng)功能缺損評分 術(shù)后24 h,運用Zea Longa法神經(jīng)功能缺損評分標準對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分:神經(jīng)缺損癥狀不明顯、活動(dòng)正常為0分,提尾時(shí)病灶對側前肢體不完全伸直為1分,向患側對側轉圈為2分,向患側對側傾倒為3分,活動(dòng)障礙、意識喪失為4分。

1.2.8腦缺血梗死灶及腦水腫體積的測定 完成神經(jīng)功能評分后,將大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后斷頭處死,立即取出腦組織放入-20 ℃冰箱,冷凍20 min后放置于腦槽內,從額極開(kāi)始向后切下厚度約2 mm的5張連續冠狀腦組織切片,并迅速置于10 mL含1% 2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC)的磷酸鹽緩沖液(PBS)中, 37 ℃避光培養30 min,每5 min晃動(dòng)、翻面1次(保證腦片著(zhù)色均勻)。染色結束后,將切片轉移到4%多聚甲醛溶液中固定24 h,取出固定好的腦切片拍照留存,應用Image J軟件(Image J 1.37v)圖像分析軟件進(jìn)行數據分析,按參考文獻［16］計算腦梗死灶體積及腦水腫體積。

1.2.9蘇木精-伊紅(HE)染色觀(guān)察腦組織神經(jīng)元變化 每組隨機取6只大鼠,于術(shù)后24 h麻醉斷頭處死,迅速取出患側額葉腦皮質(zhì)組織,用4%多聚甲醛固定標本2 h,蒸餾水浸泡4 h,脫水、浸蠟、包埋、切片等處理后進(jìn)行HE染色。高倍鏡下(400×)觀(guān)察各切片相同部位的大腦皮質(zhì)區神經(jīng)元形態(tài),每組隨機選擇皮質(zhì)區的5個(gè)視野拍照。

1.2.10流式細胞術(shù)檢測腦組織細胞凋亡 參考文獻［17］,每組隨機取6只大鼠,于術(shù)后24 h麻醉斷頭處死,收集患側額葉腦皮質(zhì)組織,用400 μL預冷PBS洗滌腦細胞2次,用30 μm孔徑的過(guò)濾器過(guò)濾,并調節細胞濃度為1×109CFU/L,以2 000 r/min離心10 min,棄上清液后加入1×膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)結合液400 μL及膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)染色液5 μL,輕懸混勻于2～8 ℃避光條件下孵育15 min,再加入碘化丙啶(PI)染色液10 μL,輕懸混勻,2～8 ℃避光條件下孵育5 min,立即用流式細胞儀檢測。流式細胞儀激發(fā)波長(cháng)為488 nm,Annexin V以FITC標記,配合PI同時(shí)染色檢測凋亡,使用525 nm的帶通濾片檢測FITC,使用610 nm的帶通濾片檢測PI,分別通過(guò)FITC和PI對數熒光散點(diǎn)圖分析凋亡細胞、活細胞和壞死細胞百分率。根據判讀標準,在雙變量流式細胞儀的散點(diǎn)圖上,左下象限顯示活細胞,左上象限顯示壞死細胞,右上象限為晚期凋亡細胞,右下象限為早期凋亡細胞。在每一散點(diǎn)圖的下方列出各象限的比例,可得到該散點(diǎn)圖中壞死細胞百分率、晚期凋亡細胞百分率、早期凋亡細胞百分率及活細胞百分率。

1.2.11Western blot驗證核心靶點(diǎn)基因的表達 每組隨機取6只大鼠,于術(shù)后24 h麻醉斷頭處死,迅速取出患側額葉腦皮質(zhì)組織加入含有適量液氮的研缽里,研磨后加入組織裂解液,放入組織勻漿機中進(jìn)行勻漿,使組織盡量碾碎,在冰上靜置15～30 min使之充分裂解。將勻漿液放入離心管中12 000 r/min離心30 min,上清轉移至新的預冷離心管中,處理蛋白隨后上樣。采用SDS-PAGE分離總蛋白,隨后用濕轉法轉移至PVDF膜上,將一抗(Caspase-3、HIF-1α、IL-6、TNF-α、GAPDH)用抗體稀釋液按適當的比例進(jìn)行稀釋,PVDF膜用一抗于4 ℃孵育過(guò)夜,然后用二抗室溫孵育2 h后顯影。將膠片進(jìn)行掃描,采用凝膠成像系統分析蛋白條帶的灰度值,目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值等于目的蛋白的相對表達水平。

1.3 統計學(xué)分析

2.1 共同靶點(diǎn)的篩選及“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò )構建

通過(guò)文獻數據庫結合PharmMapper、Swiss Target Prediction及Uniprot數據庫,獲得HBOC對應靶點(diǎn)308個(gè)、EDA對應靶點(diǎn)90個(gè)、ACI對應靶點(diǎn)1 109個(gè),在Venny 2.1在線(xiàn)軟件作圖工具平臺上,繪制維恩圖,結果顯示HBOC、EDA和ACI共同靶點(diǎn)106個(gè),見(jiàn)圖1。在Cytoscape 3.9.1軟件中輸入藥物與疾病的共同靶點(diǎn),構建“HBOC/EDA-靶點(diǎn)-ACI”網(wǎng)絡(luò )圖,見(jiàn)圖2。

注：紫色為HBOC對應靶點(diǎn),藍色為EDA對應靶點(diǎn),綠色為ACI對應靶點(diǎn),藥物與疾病的交集為共同靶點(diǎn)。

注：黃色為藥物HBOC及EDA、藍色為藥物與疾病的106個(gè)共同靶點(diǎn)、紅色為疾病ACI。

2.2 GO富集分析和KEGG通路富集分析

將HBOC聯(lián)合EDA治療ACI的共同靶點(diǎn)導入DAVID數據庫進(jìn)行GO富集分析及KEGG通路富集分析。GO富集分析顯示共同靶點(diǎn)與凋亡過(guò)程的調控、對缺氧的反應、藥物反應等生物過(guò)程相關(guān),KEGG通路富集分析顯示共同靶點(diǎn)主要參與IL-17信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路等。見(jiàn)圖3。

注：A為共同靶點(diǎn)的GO富集分析結果中P值排名前10的途徑繪制的條形圖,BP為生物學(xué)過(guò)程、CC為細胞組分、MF為分子功能;B為共同靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析結果中P值排名前20的通路繪制的氣泡圖。

2.3 “藥物-疾病-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡(luò )的構建及核心靶點(diǎn)的獲得

結果顯示,在前4個(gè)關(guān)鍵通路中有32個(gè)靶點(diǎn)被富集(圖4)。為了進(jìn)一步探討在關(guān)鍵通路中可能存在的核心靶點(diǎn),構建關(guān)鍵通路中富集的32個(gè)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò )圖結果顯示Caspase-3、HIF-1α,IL-6、TNF-α等靶點(diǎn)的節點(diǎn)相對較大,顏色相對較暗,提示有較高的度值,表明它們可能是HBOC和EDA聯(lián)合治療ACI的關(guān)鍵靶點(diǎn),可能在評價(jià)治療效果中發(fā)揮重要作用(圖5)。

注：淺紅色ACI,紫色代表4種關(guān)鍵通路,綠色表示參與通路的32個(gè)靶點(diǎn),淺棕色代表藥物(EDA與HBOC);節點(diǎn)之間的邊緣代表它們之間的相互作用。

注：圓形節點(diǎn)代表靶點(diǎn),節點(diǎn)之間的直線(xiàn)表示兩個(gè)連接蛋白之間的相互作用;圓圈越大,顏色越深,度值就越大;線(xiàn)越厚,蛋白質(zhì)之間的結合就越近。

2.4 大鼠神經(jīng)功能評分

術(shù)后24 h,模型組和各治療組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分均高于假手術(shù)組,差異有統計學(xué)意義(P<0.5); HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組的神經(jīng)功能評分低于模型組,差異有統計學(xué)意義(P<0.05),聯(lián)合治療組低于HBOC治療組和EDA治療組,差異有統計學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠術(shù)后24 h的神經(jīng)功能評分比較

2.5 大鼠腦梗死灶體積與腦水腫體積

術(shù)后24 h,與假手術(shù)組比較,模型組、HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組大鼠的腦梗死灶體積和腦水腫體積增加,差異有統計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,HBOC治療組,EDA治療組和聯(lián)合治療組的腦梗死灶體積和腦水腫體積明顯減少,差異有統計學(xué)意義(P<0.05)。其中,聯(lián)合治療組腦梗死體積和腦水腫體積明顯低于HBOC治療組和EDA治療組,差異有統計學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠術(shù)后24 h腦梗死灶體積及腦水腫體積比較

2.6 大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)觀(guān)察

結果顯示,術(shù)后24 h,假手術(shù)組大鼠腦組織中可觀(guān)察到正常神經(jīng)元細胞,神經(jīng)元排列密集整齊、層次清晰、結構完整,神經(jīng)元形態(tài)圓潤、輪廓清晰、胞內胞質(zhì)均勻、細胞核正常居中;模型組大鼠腦組織中神經(jīng)元細胞結構明顯異常,細胞排列相對紊亂,形態(tài)不規則,大量細胞皺縮,核染色質(zhì)固縮、邊集、碎片化,大量凋亡小體形成;HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組大鼠腦組織中正常神經(jīng)元細胞數量出現不同程度減少,胞體腫脹變形,排列疏松,形態(tài)不規則,核仁不同程度固縮、碎片化。HBOC治療組與EDA治療組大鼠腦組織中神經(jīng)元細胞排列較模型組清楚,較聯(lián)合治療組紊亂。聯(lián)合治療組大鼠腦組織中神經(jīng)元細胞排列規則,邊界清晰,碎片化核仁和凋亡小體顯著(zhù)減少。見(jiàn)圖6。

圖6 各組大鼠術(shù)后24 h腦組織中神經(jīng)元形態(tài)

2.7 大鼠腦組織細胞凋亡

術(shù)后24 h,與假手術(shù)組比較,模型組、HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組大鼠腦組織出現大量細胞壞死、凋亡細胞數量增多、正常細胞數量減少,差異有統計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組的凋亡細胞數量減少、正常細胞增多,差異有統計學(xué)意義(P<0.05);聯(lián)合治療組壞死細胞和凋亡細胞數量低于HBOC治療組與EDA治療組,差異有統計學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖7和表3。

表3 各組大鼠術(shù)后24 h腦組織的細胞凋亡率比較

圖7 各組大鼠術(shù)后24 h腦組織的流式細胞術(shù)檢測結果

2.8 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的表達

術(shù)后24 h,與假手術(shù)組比較,模型組、HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組大鼠腦組織的Caspase-3、HIF-1α、IL-6、TNF-α蛋白表達水平上調,差異有統計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組的Caspase-3、HIF-1α、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平下調,其中,聯(lián)合治療組的Caspase-3、HIF-1α、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平低于HBOC治療組與EDA治療組,差異有統計學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖8。

注：A為Caspase-3、HIF-1α、IL-6、TNF-α蛋白的Western blot檢測結果,B為Caspase-3、HIF-1α、IL-6、TNF-α蛋白的定量結果;(1)與假手術(shù)組相比,P<0.05;(2)與模型組相比,P<0.05;(3)與HBOC治療組相比,P<0.05;(4)與EDA治療組相比,P<0.05。

ACI發(fā)生以后,缺血腦組織會(huì )發(fā)生一系列級聯(lián)反應,梗死局部間質(zhì)水腫、腦血管受壓、微血栓聚集,進(jìn)而使紅細胞無(wú)法到達病灶部位,組織缺血缺氧對半暗帶進(jìn)一步損害,最終導致更大面積的病損及更嚴重的神經(jīng)功能缺失［18］。針對治療缺血性損傷的多種方法,聯(lián)合治療比單一治療策略具有優(yōu)勢［19-20］。本研究結合HBOC與EDA的網(wǎng)絡(luò )藥理學(xué)和生物學(xué)驗證,探討其聯(lián)合治療對ACI的神經(jīng)保護作用及相關(guān)機制。

網(wǎng)絡(luò )藥理學(xué)是一個(gè)多學(xué)科的研究領(lǐng)域,通過(guò)建立數據庫、建立網(wǎng)絡(luò )、分析網(wǎng)絡(luò )和進(jìn)行實(shí)驗驗證來(lái)解釋疾病的發(fā)展過(guò)程［21-22］。網(wǎng)絡(luò )藥理學(xué)利用組學(xué)整合了系統生物學(xué),為從生物平衡的角度探索中藥或天然活性物質(zhì)的作用機制和開(kāi)發(fā)中藥活性成分提供了有力的工具。此外,還可以直觀(guān)地呈現藥物-靶點(diǎn)-疾病的網(wǎng)絡(luò )圖,可以預測治療過(guò)程中的作用靶點(diǎn)和信號通路,進(jìn)而預測其潛在的作用機制,這是開(kāi)發(fā)新藥的有效途徑之一［23-25］。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò )藥理學(xué)預測HBOC聯(lián)合EDA治療ACI的106個(gè)共同靶點(diǎn),并分析了這些靶點(diǎn)的GO富集分析和KEGG通路富集分析,預測在治療過(guò)程中可能發(fā)揮的作用,并檢測靶點(diǎn)的程度值。結果顯示這些靶點(diǎn)參與凋亡過(guò)程的調控、對缺氧的反應等生物過(guò)程,并可能通過(guò)IL-17信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路等途徑在A(yíng)CI治療中起神經(jīng)保護作用。

為了進(jìn)一步探討在關(guān)鍵通路中可能存在的核心靶點(diǎn),本研究構建了通路中富集的32個(gè)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò ),結果顯示Caspase-3、HIF-1α,IL-6、TNF-α可作為HBOC和EDA聯(lián)合治療ACI的關(guān)鍵靶點(diǎn)。研究證實(shí),腦組織缺血缺氧后會(huì )啟動(dòng)細胞凋亡程序,細胞凋亡的過(guò)程是水解底物的級聯(lián)放大反應過(guò)程［26］。Caspase-3作為Caspase家族蛋白的凋亡執行因子,是細胞凋亡級聯(lián)反應的最終執行蛋白［27］。腦缺血損傷發(fā)生后,細胞內會(huì )生成大量氧自由基,隨著(zhù)細胞膜被逐漸破壞,溶酶體、線(xiàn)粒體等細胞器均受到不同程度損傷,凋亡蛋白Caspase-3經(jīng)不同途徑被激活,最終導致細胞凋亡。HIF-1是一種轉錄因子,它存在于人體和哺乳類(lèi)動(dòng)物的細胞內,對細胞的代謝調節以及介導機體適應低氧環(huán)境起關(guān)鍵性作用［28］。HIF-1α在細胞缺血缺氧時(shí)表達上調,位于下游的促凋亡基因表達受到調控后表達增加,進(jìn)一步促進(jìn)細胞凋亡,HIF-1α表達的上調與細胞凋亡呈正相關(guān)的關(guān)系［29］。缺血性腦損傷伴隨著(zhù)明顯的炎性反應,炎性反應由炎癥細胞的積聚和炎癥介質(zhì)的表達引起并加重,炎性反應的抑制可以保護缺血性腦損傷［30］。在炎性反應中,IL-6、TNF-α起著(zhù)重要作用。IL-6是腦缺血炎性反應的關(guān)鍵介質(zhì),其介導的神經(jīng)炎癥加重了腦損傷,在缺血和缺氧刺激下,IL-6在神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中表達明顯升高,而抑制IL-6表達可以減輕缺血缺氧造成的損傷［31］。TNF-α是腦梗死后的重要炎性因子,可直接損傷腦組織,同時(shí)能誘導局部組織產(chǎn)生炎性因子,引起炎癥級聯(lián)反應［32］。經(jīng)生物信息學(xué)預測,在本研究中,Caspase-3、HIF-1α,IL-6、TNF-α可作為HBOC和EDA聯(lián)合治療ACI的關(guān)鍵靶點(diǎn)。本研究結果也顯示,檢測Caspase-3、HIF-1α,IL-6、TNF-α含量的變化可能作為HBOC和EDA聯(lián)合治療ACI的關(guān)鍵指標,可能在評價(jià)治療效果中發(fā)揮重要作用。

本研究的生物學(xué)實(shí)驗主要在行為學(xué)水平、細胞水平、分子水平等方面進(jìn)行療效評估。神經(jīng)功能評分是評價(jià)腦損傷病情預后的重要依據［8］。本研究采用改良的神經(jīng)功能缺損評分標準評價(jià)HBOC聯(lián)合EDA對ACI大鼠神經(jīng)功能的改善效果,結果顯示聯(lián)合用藥后大鼠神經(jīng)功能評分顯著(zhù)降低。此外,研究發(fā)現聯(lián)合治療在減輕腦梗死體積和水腫體積的作用上均較單獨治療有更好的效果。提示聯(lián)合治療方案對大鼠腦梗死后的神經(jīng)功能缺損癥狀有明顯的改善作用,且其療效優(yōu)于單獨用藥方案。另一方面,本研究通過(guò)HE染色觀(guān)察各組大鼠腦組織神經(jīng)元變化,結果表明聯(lián)合用藥能有效改善腦缺血的神經(jīng)元病變。

在本研究中,模型組、HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組大鼠腦組織的Caspase-3和 HIF-1α蛋白表達水平均較假手術(shù)組明顯升高,同時(shí)通過(guò)流式細胞術(shù)檢測大鼠腦組織細胞凋亡程度顯示模型組、HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組出現大量細胞壞死,細胞凋亡數量增多,正常細胞數量明顯減少,說(shuō)明腦梗死后細胞凋亡程序被啟動(dòng),凋亡因子Caspase-3和 HIF-1α蛋白表達水平上調。通過(guò)與模型組比較,HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合治療組的Caspase-3和 HIF-1α蛋白表達水平均有不同程度的降低,流式細胞術(shù)顯示腦組織凋亡、壞死細胞比例減少、正常細胞增多,說(shuō)明在腦梗后凋亡程序的啟動(dòng)中,各治療組對細胞凋亡均表現出不同的抑制作用。其中,聯(lián)合治療組細胞壞死和細胞凋亡數量明顯低于HBOC治療組與EDA治療組,表明聯(lián)合治療對腦梗死后啟動(dòng)的凋亡程序具有更明顯的抑制作用,通過(guò)下調凋亡因子Caspase-3和 HIF-1α蛋白表達水平,從而發(fā)揮更明顯的神經(jīng)保護作用。此外,本研究發(fā)現,IL-6、TNF-α等炎癥因子在腦梗死后的蛋白表達水平表現出明顯升高趨勢,提示腦梗死后炎性反應被激活。與模型組比較,HBOC治療組、EDA治療組和聯(lián)合用藥治療組的IL-6、TNF-α蛋白表達水平均有不同程度的降低,說(shuō)明各治療組對腦梗死后出現的炎性反應均有不同程度的抑制作用。其中,聯(lián)合治療組的IL-6、TNF-α 蛋白表達水平明顯低于HBOC治療組與EDA治療組,說(shuō)明聯(lián)合用藥對腦梗死后的炎性反應的抑制作用更大,從而發(fā)揮更明顯的神經(jīng)保護作用。

綜上,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò )藥理學(xué)分析,預測HBOC與EDA聯(lián)合用藥的協(xié)同效應,并通過(guò)生物學(xué)實(shí)驗在行為學(xué)水平、細胞水平、分子水平等方面進(jìn)行療效評估,初步證明HBOC和EDA聯(lián)合治療可以明顯改善大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀,減輕腦水腫和梗死體積,抑制細胞凋亡,且療效較單一用藥更為明顯,其聯(lián)合用藥的神經(jīng)保護作用機制可能通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑方式減輕炎癥反應與細胞凋亡。本研究為今后臨床實(shí)驗的開(kāi)展和ACI的治療提供了新的思路。