早產(chǎn)兒NEC與MD-2基因多態(tài)性相關(guān)性分析

邱紅 毛仁萍 王曉珺 李艷紅 呂勤

壞死性小腸結腸炎（Necrotizing enterocolitis，NEC）是早產(chǎn)兒常見(jiàn)并發(fā)癥，可危及新生兒生命。主要癥狀是腹脹、嘔吐和血便［1-2］。主要病理癥狀是回腸末端和近端結腸的炎癥性出血性壞死，當病情嚴重時(shí)，可能會(huì )出現膿毒癥、休克和多器官功能障礙綜合征等并發(fā)癥。NEC 的病因和發(fā)病機制尚未完全明確［3-5］。因此，識別早產(chǎn)兒NEC 的危險因素和發(fā)病機制，積極預防和治療NEC，對于提高早產(chǎn)兒的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。目前，研究表明基因多態(tài)性與NEC 存在相關(guān)性［6］。MD-2 是識別脂多糖受體復合物的Toll 樣受體信號通路的關(guān)鍵成分之一［7-8］。本研究從單核苷酸多態(tài)性的角度研究基因多態(tài)性與NEC 的相關(guān)性?，F報道如下。

1.1 臨床資料 選擇2020 年1 月至2022 年12 月本院新生兒重癥監護病房收治的確診早產(chǎn)兒NEC120 例（NEC組），將功能性多態(tài)點(diǎn)與同期非壞死性小腸炎患兒120 例（非NEC 組）進(jìn)行對照分析。收集患者一般資料，主要包括性別、胎齡、標本采集日齡、出生體重、出生方式等。NEC 組納入標準：符合NEC 的Bell 分期診斷標準，且Bell 分期＞Ⅱ期。排除標準：心臟、肝、腎、神經(jīng)、呼吸道、血液嚴重疾病或先天消化道畸形、腸旋轉不良、自發(fā)性腸穿孔、病歷資料不全、入院數小時(shí)死亡等。非NEC 組納入標準：非壞死性小腸結腸炎患兒，但屬于高?；純?；
與NEC 組一般資料相匹配。排除標準同NEC 組。本研究獲得醫院倫理委員會(huì )批準。

1.2 方法 （1）MD-2 基因多態(tài)性檢測指標：MD-2 有四個(gè)外顯子。通過(guò)參考美國國家生物技術(shù)信息中心的基因序列服務(wù)數據庫和寡核苷酸多態(tài)性數據庫以及相關(guān)文獻，將MD-2 基因的1、2 和4 外顯因子和MD-2 啟動(dòng)子區的rsll465996 多態(tài)性區選為研究片段。通過(guò)基因測序觀(guān)察NEC 早產(chǎn)兒中這些基因片段的多態(tài)性，并將多態(tài)性位點(diǎn)與非NEC 組進(jìn)行比較。（2）標本采集：抽取NEC 組48 h 內和非NEC 組住院期間橈動(dòng)脈血1 mL，裝于環(huán)氧樹(shù)脂管內進(jìn)行分裝，放置冰箱保存。（3）提取基因總DNA 及目的片段擴增：采用硅基質(zhì)吸附柱法從血液樣本中提取基因組DNA，采用2×Taq Master Mix對所提取的DNA 進(jìn)行PCR 擴增，對擴增產(chǎn)物進(jìn)行一代測序（雙向測序），交由化洛生物科技（上海）有限公司進(jìn)行合成。PCR 擴增引物及測序引物。見(jiàn)表1。（4）產(chǎn)物電泳：使用2%瓊脂糖對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并將其與標記進(jìn)行比較，以確定產(chǎn)物的大小是否與目標片段一致。見(jiàn)表2。（5）產(chǎn)物純化與測序：電泳后，PCR產(chǎn)物送至化洛生物科技（上海）有限公司按照操作流程進(jìn)行純化測序。見(jiàn)表3。

表1 PCR擴增引物及測序引物

表2 D-2基因外顯因子和多態(tài)性的PCR擴增體系

表3 D-2基因外顯因子和多態(tài)性的PCR程序

1.3 統計學(xué)方法 采用SPSS 24.0 統計軟件。計量資料以（±s）表示，用t檢驗；
計數資料以n（%）表示，用卡方檢驗。P＜0.05 為差異有統計學(xué)意義。

2.1 兩組一般資料比較 見(jiàn)表4。

表4 兩組一般資料比較

2.2 外顯因子基因多態(tài)位點(diǎn)的測序 NEC 組中未檢測出功能性多態(tài)性的位點(diǎn)。

2.3 啟動(dòng)子區域C-1625G 多態(tài)性的位點(diǎn) NEC 組C/C基因型頻率為54.2%，C/G 基因型頻率為45.8%，非NEC組C/C 基因型頻率為65.0%，C/G 基因型頻率為35.0%，兩組比較差異無(wú)統計學(xué)意義（P＞0.05）。手術(shù)組C/C 基因型頻率為50.0%，C/G 基因型頻率為50.0%，與非NEC組比較，差異有統計學(xué)意義（P＜0.05）。NEC 組G 等位基因型頻率為22.9%，非NEC 組G 等位基因型頻率為11.7%，兩組比較差異無(wú)統計學(xué)意義（P＞0.05）；
手術(shù)組G 等位基因型頻率為10.4%，與非NEC 組比較，差異有統計學(xué)意義（P＜0.05）。手術(shù)組G 等位基因頻率與非手術(shù)組比較，差異無(wú)統計學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表5。

表5 NEC組與非NEC組的基因型和等位基因的分布頻率

2.4 非手術(shù)組與手術(shù)組轉歸比較 見(jiàn)表6。

表6 非手術(shù)組與手術(shù)組轉歸比較（n）

國內研究指出，NEC 的病因可能與早產(chǎn)兒、腸道喂養、缺氧缺血有關(guān)。NEC 發(fā)生敗血癥時(shí)體內細菌會(huì )大量繁殖生成毒素導致炎癥反應與抗炎失衡，最終引發(fā)腸黏膜壞死［9］。但暴露于相同環(huán)境或干預條件，NEC 也僅發(fā)生于一部分新生兒（尤其早產(chǎn)兒）；
且不同新生兒病情嚴重程度差別較大，因此，遺傳背景可能在NEC發(fā)病中起重要作用［10］。

MD-2是識別脂多糖受體復合物的Toll樣受體信號通路的關(guān)鍵成分之一。研究指出，MD-2 的轉錄效率會(huì )受rsll46599 多態(tài)性位點(diǎn)的影響，而MD-2 外顯因子1 號發(fā)生變異會(huì )降低LPS 發(fā)出信號［11］。在新生兒中，NEC發(fā)病的主要因素與TLR4 信號通路異常調控有關(guān)。而MD-2 是TLR4 信號通路的輔助因子，若發(fā)生轉錄和功能改變會(huì )影響TLR4信號通路的轉錄與活化。本研究中，NEC 組并未檢測出功能性多態(tài)性的位點(diǎn)，表明MD-2 蛋白結構改變可能與NEC 疾病的發(fā)生無(wú)相關(guān)性。有研究指出，MD-2 錯義突變會(huì )導致結構變化，降低MD-2 的受體和LPS 的結合能力，但可能與NEC 的發(fā)生無(wú)關(guān)［12］。

rsll465996 是MD-2 基因中較為常見(jiàn)的研究位點(diǎn)，若基因頻率發(fā)生改變可能會(huì )影響MD-2 基因的轉錄功能。有研究顯示，rsll465996 基因位點(diǎn)與敗血癥的發(fā)生密切相關(guān)［13］。GU 等指出，MD-2 基因位點(diǎn)的活性受該位點(diǎn)的影響［14］。本研究中，NEC 組C/C 基因型頻率與和C/G 基因型的頻率與非NEC 組基因頻率比較差異無(wú)統計學(xué)意義（P＞0.05）；
手術(shù)組G 等位基因型頻率與非NEC 組比較，差異有統計學(xué)意義（P＜0.05）。手術(shù)組G 等位基因頻率與非手術(shù)組比較，差異無(wú)統計學(xué)意義（P＞0.05）。表明NEC 的嚴重程度與rsll465996 位點(diǎn)的G等位基因有關(guān)。

臨床上對NEC 患兒的手術(shù)時(shí)機的選擇和手術(shù)效果，一直存在較大爭議。本研究中，手術(shù)組患兒為重癥NEC，患兒出現腹脹、便血、低血壓、經(jīng)皮氧飽和度波動(dòng)等，實(shí)驗室檢查提示感染指標升高、酸堿平衡紊亂、電解質(zhì)紊亂，腹部影像學(xué)檢查提示腹水、固定腸袢、 腸蠕動(dòng)減少或消失等時(shí)，內科保守治療無(wú)效或病情進(jìn)展，需要考慮手術(shù)治療。本研究顯示手術(shù)組治愈率低于非手術(shù)組，預后不良發(fā)生率高于非手術(shù)組，這與NEC 手術(shù)組患兒存在腸道感染重且進(jìn)展快有關(guān)。rsll465996 基因位點(diǎn)與感染發(fā)生密切相關(guān)，手術(shù)組該基因G 等位基因型頻率高于非NEC 組和非手術(shù)組，因此rsll465996 基因G 等位基因型頻率高與手術(shù)適應證及預后存在相關(guān)性。

綜上，早產(chǎn)兒NEC 發(fā)病與MD-2 基因的外顯因子基因多態(tài)性無(wú)關(guān)，但疾病的嚴重程度、手術(shù)適應證可能與G 等位基因有關(guān)。但本次研究由于樣本量較少，并未進(jìn)一步探討炎性因子基因多態(tài)性是否與NEC 有關(guān)，因此具有有一定的局限性，今后還需納入更多樣本量來(lái)進(jìn)行研究。