皇帝蕉組織培養快速繁殖技術(shù)研究

樊憲偉,李志芳,韓向峰,王廣琪

(1 廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,南寧,530004;2 廣東佛山市農業(yè)科學(xué)研究所,廣東佛山,528145)

皇帝蕉MusaparadisiacaAA是我國南方種植重要草本果樹(shù),又被稱(chēng)為貢蕉、甜蕉、帝王蕉等,其果實(shí)較小巧,皮較薄,含糖量高,營(yíng)養豐富,且有特殊的芳香味,廣受大眾喜愛(ài),較普通香蕉具有更高的商品價(jià)值[1-3]。由于皇帝蕉多以芽進(jìn)行無(wú)性繁殖,生產(chǎn)中易受尖孢鐮刀菌等真菌為害,致使皇帝蕉的產(chǎn)量和品質(zhì)下降[5]。因此,建立皇帝蕉快速組織培養體系是脫毒、預防真菌病害的有效途徑。

國內皇帝蕉栽培技術(shù)方面研究較多[2,5-6],組織培養方面相對較少。朱靖杰等[7]首次利用試管苗莖段薄片誘導出胚性愈傷組織,進(jìn)一步分化為芽,獲得再生植株。王麗萍等[8]利用吸芽為外植體,通過(guò)消毒處理和植物生長(cháng)調節劑組合建立了皇帝蕉快速繁殖體系。本研究利用皇帝蕉球莖,優(yōu)化培養消毒處理和植物生長(cháng)調節劑組合,建立了皇帝蕉組織培養簡(jiǎn)化體系,為皇帝蕉生產(chǎn)提供參考。

1.1 材料

2011年5月采自佛山市農業(yè)科學(xué)研究所大田引種的皇帝蕉種苗供試,選健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的地下球莖作為外植體。

1.2 方法

外植體消毒方法篩選:采取健壯外植體,去除泥土、根等雜物洗凈后剝去外層葉鞘,用洗潔精擦洗,再用自來(lái)水流水沖洗30 min,將材料放置在超凈工作臺上。設置不同消毒方式處理,即75%酒精30 s+0.1%升汞15 min;75%酒精30 s+0.1%升汞10 min;75%酒精30 s+0.1%升汞10 min消毒兩次(第一次消毒后的酒精和汞回收再次使用)等3個(gè)處理。消毒后球莖切成1 cm3塊,迅速放入初代培養基,即MS+細胞分裂素6-芐氨基嘌呤1.5 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L中培養,每個(gè)外植體單獨放1瓶,每處理復3次,每個(gè)重復10瓶,10 d后調查3種不同消毒處理的污染情況及發(fā)芽狀態(tài),污染率(%)=污染數/接種數×100。

繼代、生根培養基:MS培養基每升添加蔗糖30 g、瓊脂5.5 g,pH值5.8～6.0。

增殖培養基:以MS培養基為基礎培養基,添加不同濃度6-芐氨基嘌呤、吲哚乙酸等植物生長(cháng)調節劑誘導吸芽萌發(fā)、增殖,即MS+6-芐氨基嘌呤1.0 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L、MS+6-芐氨基嘌呤2.0 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L和MS+6-芐氨基嘌呤2.5 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L等3個(gè)處理,篩選適宜的增殖培養基。

生根培養基:以MS培養基為基礎培養基,設置1/2MS+吲哚乙酸0.4 mg/L和1/2MS+吲哚乙酸0.2 mg/L兩個(gè)處理。

繼代試驗每瓶接種芽苗10株,重復3次,每個(gè)重復接種5瓶,30 d后調查平均分化系數及芽體生長(cháng)情況,平均分化系數(%)=分化不定芽株數/接種株數×100;生根試驗每瓶接種芽苗12株,重復3次,每個(gè)重復接種6瓶,20 d后調查生根率、有效生根率及根系生長(cháng)情況,生根率(%)=生根株數/接種株數×100,有效生根率(%)=具有2條以上粗壯根株數/接種株數×100。

除初培和生根試驗需要暗培養,其余試驗培養光照均為1 500～2 000 Lx,溫度(23±2) ℃,每2～3 d觀(guān)察1次,并做好記錄。通過(guò)初培、繼代、生根培養試驗,篩選快速繁殖的最佳培養處理。

煉苗試驗方法:先進(jìn)行3 d閉瓶煉苗,再經(jīng)過(guò)3 d開(kāi)瓶煉苗,然后將生根幼苗從培養瓶慢慢取出,用流水輕輕沖洗掉根系上的培養基,并用0.1%多菌靈殺菌液清洗;最后將幼苗分別種植在消毒后不同基質(zhì)營(yíng)養盤(pán)中,即設置泥炭土、塘泥+椰糠、椰糠等3種不同基質(zhì),重復3次,每個(gè)重復生根苗約40株,20 d后統計煉苗成活率,成活率(%)=成活株數/種植株數×100。

1.3 數據分析

數據采用SPSS軟件進(jìn)行多重比較或T-test,在p<0.05時(shí)差異顯著(zhù)。

2.1 初代培養情況

皇帝蕉外植體在初代培養基上均呈現不同程度褐變,接種時(shí)間越短,褐變越輕;培養1周后外植體開(kāi)始膨大,由最初的乳白色逐漸轉綠;生長(cháng)點(diǎn)部位開(kāi)始凸起,10 d左右開(kāi)始露出芽點(diǎn);15～20 d后,中心生長(cháng)點(diǎn)周?chē)_(kāi)始出現許多淡黃或淺綠色的不定芽,然后逐漸轉為黃綠,漸漸長(cháng)出許多葉片變成完整芽體(見(jiàn)圖1)。

圖1 皇帝蕉組培及田間種植生長(cháng)情況

2.2 不同消毒處理的影響

消毒處理的外植體培養3 d,部分材料發(fā)生少量細菌污染,5 d部分材料出現霉菌污染,10 d調查污染率發(fā)現,75%酒精30 s+0.1%升汞15 min處理的污染率較低,為33.3%,污染少,褐變重,出芽少,少量死亡,誘導出芽少;75%酒精30 s+0.1% 升汞10 min處理的污染率為43.3%,褐變較輕,菌少,出芽較多;消毒兩次處理的污染率最高,為50.0%,褐變輕,細菌污染較多,與75%酒精30 s+0.1%升汞15 min處理的污染率差異顯著(zhù)(見(jiàn)表1)。結合污染及生長(cháng)情況認為,75%酒精30 s+0.1%升汞10 min消毒處理對初代培養效果較好。

表1 不同消毒處理對初代培養及不同增殖培養基對不定芽增殖的影響

2.3 不同增殖培養基的影響

不同增殖培養基處理的不定芽增殖存在顯著(zhù)性差異,MS+6-芐氨基嘌呤2.5 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L處理的不定芽增殖效果最好。3個(gè)增殖培養基中,隨著(zhù)6-芐氨基嘌呤處理濃度升高,繼代苗的生根量減少,只有個(gè)別大芽有生根現象(見(jiàn)表1和圖1)。

2.4 不同濃度吲哚乙酸對生根的影響

皇帝蕉易生根,在生根培養基上培養5 d時(shí)產(chǎn)生少量根,培養10 d后大部分組培苗生根,根長(cháng)1 cm左右,且無(wú)愈傷組織產(chǎn)生(見(jiàn)圖1)。1/2MS +吲哚乙酸0.4 mg/L處理的生根率為94.0%,有效生根率(單株生根數>2條)為86.0%,單株多為4條根,根粗壯,生根效果較好;1/2MS+吲哚乙酸0.2 mg/L處理的生根率為89.5%,有效生根率為80.0%,單株生根2～3條,單根較多,根細,生根效果一般,2個(gè)處理之間無(wú)顯著(zhù)性差異(見(jiàn)表2)。2個(gè)處理隨著(zhù)吲哚乙酸濃度增加,單株生根量增加,根也較粗壯,有效生根率也提高。

表2 不同濃度吲哚乙酸對皇帝蕉組培苗生根及基質(zhì)對移栽的影響

2.5 不同基質(zhì)的影響

3個(gè)基質(zhì)處理的移栽成活率無(wú)顯著(zhù)性差異,移栽成活率均大于97%(見(jiàn)表2)?；实劢渡L(cháng)對土質(zhì)要求不嚴格,在泥炭土、椰糠、塘泥+椰糠的基質(zhì)上均能良好生長(cháng)。因此,只要溫濕度和光照合適,皇帝蕉組培苗生長(cháng)勢都較強,供試基質(zhì)對煉苗成活率無(wú)顯著(zhù)性影響,均能達到較好的煉苗效果(見(jiàn)圖1);組培苗營(yíng)養情況差異也較小,只要后期肥水管理到位,對成品苗的生長(cháng)并無(wú)影響。

2.6 組培苗田間生長(cháng)情況

田間觀(guān)察發(fā)現,皇帝蕉組培苗生長(cháng)整齊度高,染病少,組培皇帝蕉果指中大,口感甜,產(chǎn)量高,品質(zhì)好(見(jiàn)圖1)。巴西蕉是當地香蕉主栽品種,產(chǎn)量是皇帝蕉的2倍多;但巴西蕉田間批發(fā)價(jià)格較低,最高2元/kg左右,而皇帝蕉批發(fā)價(jià)5元/kg左右,皇帝蕉的經(jīng)濟價(jià)值比巴西蕉高。

試驗中,皇帝蕉外植體不同消毒處理后污染率偏高,可能由于當時(shí)采樣期間連續降雨高溫,材料采自泥水浸泡的地下塊莖部分,外植體攜帶菌群較多,組培條件菌類(lèi)繁殖速度快且多;若在干旱少雨季節取材料,污染率應該會(huì )降低,有待進(jìn)一步驗證。同時(shí),研究發(fā)現隨著(zhù)消毒時(shí)間延長(cháng),升汞對植物的毒害殺傷作用也越強,輕者殺傷褐變,影響芽萌發(fā),重者直接導致材料死亡。鑒于升汞對環(huán)境具有污染性,后期試驗可嘗試用次氯酸鈉或其他消毒劑代替升汞作為外植體的消毒試劑。

香蕉組織培養中容易發(fā)生褐化。本試驗研究發(fā)現,皇帝蕉在組織培養過(guò)程中較其他植物材料易褐變,且褐變嚴重時(shí)會(huì )影響皇帝蕉發(fā)芽,創(chuàng )傷面越大褐變越厲害,材料越老越容易褐變;隨著(zhù)繼代次數增加和創(chuàng )傷面減小,褐變現象會(huì )減輕,說(shuō)明幼嫩組織褐變輕。因此,選取外植體時(shí)應盡量靠近地上部分新生芽,較小的吸芽作為外植體可能會(huì )減少污染及減輕褐變現象。

細胞分裂素和生長(cháng)素濃度配比是決定組織培養誘導叢生芽的關(guān)鍵因素。王麗萍等[8]研究指出,6-芐氨基嘌呤3.0 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L時(shí)皇帝蕉增殖較快。本研究采用初代培養基進(jìn)行吸芽誘導,發(fā)現增加細胞分裂素——6-芐氨基嘌呤的濃度,即MS+6-芐氨基嘌呤2.5 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L時(shí),皇帝蕉增殖最快,分化不定芽系數達到3.3;且不定芽無(wú)玻璃苗,芽體飽滿(mǎn),長(cháng)勢健壯。有研究發(fā)現,采用MS+3-吲哚丁酸2.5 mg/L+萘乙酸0.2 mg/L最適合皇帝蕉幼苗促根培養[8]。本研究發(fā)現,1/2MS+吲哚乙酸0.4 mg/L生根培養基效果較好,生根率達到94%,根系健壯、發(fā)達,這也是煉苗期間皇帝蕉成活率高的基礎?；实劢渡蛋l(fā)達,煉苗期間對不同基質(zhì)適應性廣,成活率均在97%以上。田間觀(guān)察發(fā)現,供試皇帝蕉組織培養苗生長(cháng)速度快,整齊度高,無(wú)病毒病和尖孢鐮刀菌枯萎病發(fā)生。