基于網(wǎng)絡(luò )藥理學(xué)及代謝產(chǎn)物分析白首烏對乙醇性肝損傷的作用機制

宋婉鈺 李勇 李春陽(yáng) 馮進(jìn) 吳承東 馬永強

摘要：通過(guò)網(wǎng)絡(luò )藥理學(xué)及分子對接技術(shù)闡述一年生、多年生白首烏代謝產(chǎn)物對乙醇性肝損傷的作用機制。使用液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析白首烏提取物的化學(xué)組成，通過(guò)PubChem數據庫及文獻查找方法篩選出具有生物活性的成分，預測成分靶點(diǎn)、獲取疾病靶點(diǎn)并通過(guò)構建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò )，篩選關(guān)鍵成分及核心靶點(diǎn)，最后對交集靶點(diǎn)進(jìn)行富集通路分析與分子對接及可視化處理。經(jīng)過(guò)篩選發(fā)現，白首烏含有25種已認證的生物活性因子，其在多年生白首烏中的含量顯著(zhù)高于一年生白首烏（活性成分有20種）；
一年生白首烏中含量顯著(zhù)高于多年生白首烏（活性成分有5種），驗證了白首烏主要活性成分中的多糖類(lèi)、氨基酸類(lèi)能與潛在作用靶點(diǎn)發(fā)生相互作用。最后得出，一年生白首烏中的成分是通過(guò)減少細胞色素活性及減輕炎癥反應來(lái)抑制乙醇性肝損傷及相關(guān)疾病，多年生白首烏中的成分則是通過(guò)影響基因表達及能量代謝途徑來(lái)實(shí)現保護肝臟的功能。

關(guān)鍵詞：白首烏；
代謝產(chǎn)物分析；
網(wǎng)絡(luò )藥理學(xué)；
分子對接；
乙醇性肝損傷

中圖分類(lèi)號：R285.5??文獻標志碼：A??文章編號：1002-1302（2023）09-0166-09

基金項目：江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng )新資金［編號：CX（20）2006）］。

作者簡(jiǎn)介：宋婉鈺（1996—），女，山東黃縣人，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：wanyu18545546152@126.com。

通信作者：李春陽(yáng)，博士，研究員，研究方向為營(yíng)養與活性功能。E-mail：lichunyang968@126.com。

白首烏（Cynanchum auriculatum Royle ex Wight）是蘿藦科鵝絨藤屬植物耳葉牛皮消的塊根，別稱(chēng)隔山消、隔山撬、白人參、和平參、白木香、山花旗等，廣泛分布于華東、中南及河北、陜西、甘肅等地［1］。我國95%的白首烏產(chǎn)自江蘇濱海地區，2010年濱海白首烏獲得國家質(zhì)監總局地理標志保護產(chǎn)品認證，并于2012年成為江蘇省地理標志產(chǎn)品。

目前，有關(guān)一年生白首烏功效的報道較多，主要集中在抗腫瘤［2］、保肝護肝［3］與免疫調節［4］等方面，而關(guān)于多年生白首烏活性成分組成、含量及生物功能性差異等方面的研究則鮮見(jiàn)報道。本研究基于液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（liquid chromatography-time of flight mass spectrometry，LC-QTOF/MS）及網(wǎng)絡(luò )藥理學(xué)技術(shù)，對一年生白首烏與多年生白首烏提取物的活性組成、含量進(jìn)行較為系統的研究，同時(shí)對兩者生物活性功能進(jìn)行比較及預測，以期為白首烏產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)提供有效的理論依據。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

白首烏由鹽城果老首烏科技有限公司提供。分析純乙醇（批號：20200319），購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2?儀器與設備

LC-QTOF/MS高效液相色譜（安捷倫1260）串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（AB SCIEX TOF 5600+），購自安捷倫科技有限公司；
FD-2A真空冷凍干燥機，購自北京博醫康實(shí)驗儀器有限公司；
L3-5K臺式低速離心機，購自湖南可成儀器設備有限公司；
RE52-A旋轉蒸發(fā)儀，購自上海亞榮生化儀器廠(chǎng)。

1.3?試驗方法

1.3.1?LC-QTOF/MS分析白首烏提取液?將一年生白首烏、多年生白首烏凍干后研磨成粉末。稱(chēng)取相同質(zhì)量的白首烏粉末，以乙醇為溶劑，熱回流提取1.5 h，提取溫度為70 ℃，于4 500 r/min離心15 min并收集上清液。將白首烏殘渣經(jīng)過(guò)2次提取離心后，合并2次離心所得上清液，減壓濃縮至無(wú)醇味，冷藏靜置2 h，過(guò)濾，得到白首烏提取液。

1.3.1.1?LC-QTOF/MS條件?參考劉啟月等的方法［5］。色譜柱：XSelect HSS T3（4.6 mm×150.0 mm，3.5 μm）；
正電離模式流動(dòng)相A為0.1%甲酸/水，流動(dòng)相B為乙腈；
負電離模式流動(dòng)相A為0.005 mol/L乙酸銨，流動(dòng)相B為乙腈。質(zhì)譜條件：QTOF/MS全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍為50～1 000 質(zhì)荷比；
正、負電離模式的源電壓分別為 5 500、4 500 V；
簾氣、霧化器和加熱氣體的流動(dòng)壓力分別為25、50、50 psi；
正、負模式離子源電壓分別為30、-30 V。

1.3.1.2?LC-QTOF/MS數據處理?用MS-DI-AL軟件進(jìn)行相似性匹配來(lái)鑒定化合物?；衔镨b定后，采用RStudio進(jìn)行主成分分析，隨后通過(guò)Excel 2016的T TEST公式進(jìn)行計算，將表現為顯著(zhù)（P<0.05）的數據采用TBtools進(jìn)行聚類(lèi)分析?；谝荒晟?、多年生白首烏差異代謝物，進(jìn)一步通過(guò)PubChem網(wǎng)站、類(lèi)藥五原則（lipinski rules）［6］及相關(guān)參考文獻對差異代謝物進(jìn)行進(jìn)一步分析注釋?zhuān)Y選出具有生物活性功能的差異代謝物。

1.3.2?成分靶點(diǎn)預測及疾病靶點(diǎn)篩選?從PubChem網(wǎng)站獲得各個(gè)成分的Smiles化學(xué)結構式，首先將Smiles化學(xué)結構式上傳到Swiss Target Prediction網(wǎng)站，選擇“Homo sapiens”作為研究物種，獲得該成分可能的靶點(diǎn)蛋白信息。同時(shí)將Smiles化學(xué)結構式上傳到Similarity Ensemble Approach （SEA）網(wǎng)站，獲得預測靶點(diǎn)信息，再通過(guò)Excel篩選出“HUMAN”作為研究物種，得到可能的靶點(diǎn)信息。最后將2個(gè)數據庫得到的成分靶點(diǎn)蛋白信息進(jìn)行去重，整合取并集，分別得到一年生白首烏、多年生白首烏潛在的作用靶點(diǎn)。

在KEGG DISEASE網(wǎng)站上檢索乙醇性肝損傷，得到“Alcoholic liver disease”，再以“Alcoholic liver disease”為關(guān)鍵詞，分別在Therapeutic Target Database（TTD）、PharmGKB、Drugbank和Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）數據庫中進(jìn)行搜索，可得到與乙醇性肝損傷相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，對得到的靶點(diǎn)進(jìn)行去除假陽(yáng)性、去重處理，得到與乙醇性肝損傷相關(guān)靶點(diǎn)的總和。

用Venny 2.1.0軟件繪制Venn圖，將成分與疾病的靶點(diǎn)蛋白相交，得到作為活性成分緩解抑制疾病的靶點(diǎn)。將活性成分與UniProt網(wǎng)站中獲取的靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，導入Cytoscape 3.7.2中繪制白首烏-成分-疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò )圖。

1.3.3?PPI網(wǎng)絡(luò )構建?通過(guò)STRING 11.5數據庫，繪制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互作用的網(wǎng)絡(luò )圖（PPI）。通過(guò)RStudio，將數據庫數據以大于中位值作為關(guān)鍵靶點(diǎn)的標準進(jìn)行篩選后，導入Cytoscape 3.7.2中，對目前的相互作用靶點(diǎn)進(jìn)行拓展，發(fā)現直接靶點(diǎn)與間接靶點(diǎn)之間產(chǎn)生的內在聯(lián)系，進(jìn)而進(jìn)行全面考察，最終得到治療疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)及其對應的活性成分。

1.3.4?富集分析?將活性成分的靶點(diǎn)蛋白通過(guò)DAVID數據庫中的“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”基因名進(jìn)行識別，以“Homo sapiens”為研究對象，得到GO、KEGG及WIKI數據；
再利用Bioinformatics網(wǎng)站中的富集分析工具對靶點(diǎn)進(jìn)行信號通路分析。

1.3.5?成分-靶點(diǎn)分子對接驗證?在RCSB PDB數據庫中獲取靶點(diǎn)蛋白的3D結構，在PyMOL 2.5.0軟件中進(jìn)行去除水分子、游離配體后，將其命名為受體文件；
在PubChem數據庫中獲取小分子成分的3D結構，通過(guò)Open Babel軟件進(jìn)行格式轉化，將其命名為配體文件。最后將受體蛋白、配體通過(guò)AutoDock 4進(jìn)行分子對接。以最低結合能為標準篩選可能的分子對接結構，最后通過(guò)PyMOL 2.5.0軟件對對接結果進(jìn)行可視化處理。

2?結果與分析

2.1?代謝產(chǎn)物分析

對檢測數據進(jìn)行主成分分析（PCA）與聚類(lèi)分析。由圖1可以看出，一年生白首烏（OA）、多年生白首烏（OB）表現為明顯的離散型，表明兩者在成分組成、含量方面確實(shí)存在顯著(zhù)差異。這可能是因為隨著(zhù)栽培年限的增加，白首烏次級代謝產(chǎn)物的種類(lèi)、含量發(fā)生了顯著(zhù)變化。

如圖1所示，一年生白首烏（a01、a02和a03）與多年生白首烏（b01、b02和b03）中含量存在顯著(zhù)差異的成分有117種，其中烯丙基丁酮、檸檬酸及鳥(niǎo)氨酸等多種氨基酸成分在多年生白首烏中的含量顯著(zhù)高于一年生白首烏中的含量，而煙酰胺、蔗糖及膽堿等成分在多年生白首烏中的含量卻顯著(zhù)低于一年生白首烏中的含量（P<0.05）。

通過(guò)對117種存在含量差異的成分進(jìn)行Lipinski篩選，以相對分子量＜500、脂水分配系數＜5、氫鍵供體數＜5、氫鍵受體數＜10和旋轉鍵＜10為標準，找出了67種符合標準的成分，又根據在PubChem網(wǎng)站中的查找結果及參考大量文獻，發(fā)現白首烏含有25種已認證的生物活性因子，其中在多年生白首烏中含量顯著(zhù)高于一年生白首烏的活性成分有20種，在一年生白首烏中含量顯著(zhù)高于多年生白首烏的活性成分有5種。對各成分進(jìn)行功能注釋?zhuān)⒔Y果匯總于表1，發(fā)現上述20種多年生白首烏成分主要具有緩解乙醇性肝損傷和抗腫瘤等功能，而一年生白首烏中的5種活性成分則主要表現為抗氧化及保肝護肝等功能。

2.2?成分靶點(diǎn)預測及疾病靶點(diǎn)篩選

將一年生白首烏中5種活性成分的Smiles化學(xué)結構式上傳到Swiss Target Prediction網(wǎng)站和SEA網(wǎng)站，得到預測靶點(diǎn)，進(jìn)行去重整合后，得到189個(gè)作用靶點(diǎn)。從TTD、OMIM、PharmGKB及DrugBank這4個(gè)數據庫中搜索與乙醇性肝損傷相關(guān)的靶點(diǎn)，去除假陽(yáng)性及去重后，得到583個(gè)疾病靶點(diǎn)，將一年生白首烏中的活性成分靶點(diǎn)和乙醇性肝損傷疾病靶點(diǎn)相交，得到11個(gè)相交靶點(diǎn)（圖2-A）。同時(shí)，對多年生白首烏中20種活性成分的701個(gè)作用靶點(diǎn)與乙醇性肝損傷疾病靶點(diǎn)相交，得到35個(gè)相交靶點(diǎn)（圖2-B）。將相關(guān)信息導入Cytoscape 3.7.2軟件后，得到白首烏-成分-疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò )圖。如圖2-C、圖2-D所示，在一年生白首烏中，間可他酮有5個(gè)靶點(diǎn)，煙酰胺有2個(gè)靶點(diǎn)，谷氨酸有3個(gè)靶點(diǎn)；
在多年生白首烏中，腺苷、色氨酸各有10個(gè)靶點(diǎn)，海戈寧、酪氨酸各有9個(gè)靶點(diǎn)，丹皮酚有5個(gè)靶點(diǎn)，賴(lài)氨酸有4個(gè)靶點(diǎn)，焦谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、哌啶甲酸及對羥基苯甲酸甲酯分別有3個(gè)靶點(diǎn)，谷氨酰胺、天冬酰胺及剩余氨基酸分別有2個(gè)靶點(diǎn)。

2.3?PPI網(wǎng)絡(luò )的構建

將多年生白首烏及一年生白首烏與乙醇性肝損傷的共同靶點(diǎn)上傳至STRING 11.5數據庫中，得到PPI網(wǎng)絡(luò )。將結果通過(guò)RStudio以大于中位值作為關(guān)鍵靶點(diǎn)的標準進(jìn)行篩選后得到核心靶點(diǎn)。圖 3-A 為一年生白首烏成分干預下的乙醇性肝損傷靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò )，其中CYP3A4、REN、NR3C1及IL6為一年生白首烏成分緩解抑制乙醇性肝損傷的4個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。圖3-B中的NOS3、EGFR、REN、NT5E、CYP3A4、PPARA、MTOR、FASN、PPARG、NR3C1、 ALB及ADORA2A為多年生白首烏成分緩解抑制乙醇性肝損傷的12個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.4?富集分析

通過(guò)Bioinformatics網(wǎng)站中的富集分析工具對一年生白首烏、多年生白首烏干預乙醇性肝損傷的靶點(diǎn)基因進(jìn)行分析，得到如圖4、圖5的富集結果。如圖4所示，一年生白首烏預防乙醇性肝損傷的靶點(diǎn)參與了對脂多糖、氨基酸和糖皮質(zhì)激素等的反應過(guò)程，這些靶點(diǎn)主要集中在蛋白復合物、細胞質(zhì)及細胞外液等部位，具有結合類(lèi)固醇、細胞增殖、中性粒細胞介導免疫、精氨酸分解代謝、正向調節趨化因子的產(chǎn)生和調節血壓等功能，靶點(diǎn)主要集中在血管緊張素轉化酶抑制劑通路、尿素循環(huán)及轉錄因子在脂肪形成中的調控等相關(guān)途徑。由圖5可知，多年生白首烏預防乙醇性肝損傷的靶點(diǎn)參與了對過(guò)氧化氫、維生素A、有機氮化合物及固定激素等反應過(guò)程，這些靶點(diǎn)主要集中在等離子體膜、細胞質(zhì)以及細胞外液等部位，具有結合蛋白、激活轉錄因子及信號轉導等功能，這些靶點(diǎn)主要富集在胰島素、脂肪細胞因子、AMPK、HIF-1、mTOR、cAMP、PI3K-Akt與ErbB等信號通路及淀粉、蔗糖和藥物等代謝途徑。

2.5?分子對接驗證

在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò )圖中，多年生白首烏的12個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)對應的成分為腺苷、海戈寧、腺嘌呤、丹皮酚（2-羥基-4-甲氧基苯乙酮）及L-焦谷氨酸等，由于靶點(diǎn)蛋白是執行功能的主要物質(zhì)，因此選擇EGFR、REN、NT5E、MTOR、FASN、NR3C1及ADORA2A對應的成分進(jìn)行分子對接驗證。在一年生白首烏中選擇CYP3A4、IL6對應的煙酰胺、間可他酮進(jìn)行分子對接驗證。如圖6所示，所選分子對接的能量均小于0，同時(shí)每個(gè)成分都結合在靶點(diǎn)蛋白的空腔內 因此可以推測每個(gè)組分在細胞內都可以與靶點(diǎn)自發(fā)結合形成靶點(diǎn)-配體二元復合物。

3?結論與討論

根據數據庫查詢(xún)結果對差異成分進(jìn)行靶點(diǎn)預測及比較，發(fā)現多年生白首烏對肝臟具有更好的保護作用。在多年生白首烏中，色氨酸、酪氨酸和賴(lài)氨酸等成分具有較多靶點(diǎn)，經(jīng)過(guò)關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選后，得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)對應的成分為腺苷、海戈寧、腺嘌呤、丹皮酚及L-焦谷氨酸，表明這些成分在保護肝臟方面都具有一定作用，其中腺苷［7］、海戈寧［8］、腺嘌呤［9］、丹皮酚［10］及L-焦谷氨酸［11］起到了主要作用，而其他成分則通過(guò)促進(jìn)靶點(diǎn)與關(guān)鍵靶點(diǎn)的相互作用來(lái)保護肝臟。

有研究發(fā)現，一次性或長(cháng)期大量飲用含有乙醇的飲品后，乙醇及其代謝物在人體內代謝進(jìn)入肝臟，刺激各種細胞釋放出三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），被水解的一磷酸腺苷再用胞外CD73（5′-nucleotidase，NT5E）將其水解成腺苷，大量腺苷積聚后啟動(dòng)免疫反應，釋放出炎癥因子，使機體在短期內形成乙醇性肝損傷，長(cháng)期的炎癥因子刺激肝星狀細胞活化后分泌膠原，從而形成慢性乙醇性肝纖維化［12］。除循環(huán)腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS）外，活化的肝星狀細胞高表達肝臟局部RAS能以不同分泌方式在肝細胞脂肪沉積、調節肝臟功能等方面發(fā)揮重要作用［13］，并且抑制CD73、CD39可以阻斷腺苷A2A（adenosine A2a receptor，ADORA2A）和腺苷A2B受體的激活及TGF-β/Smad3通路的形成，從而阻止星狀細胞的活化，緩解急性乙醇性肝損傷、慢性乙醇性肝纖維化。靶點(diǎn)表皮生長(cháng)因子受體erbB1（epidermal growth factor receptor erbB1，EGFR）就是ATP-CD39-CD73信號通路和ATP代謝通路中緩解抑制乙醇性肝損傷的預防靶點(diǎn)［14］。長(cháng)期大量攝入乙醇會(huì )過(guò)度激活肝細胞MTOR復合物1，表現為肝細胞蛋白磷酸化水平升高。依賴(lài)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase，MTOR）相互作用蛋白的MTOR復合物1受到抑制時(shí)，會(huì )減弱由乙醇誘導的細胞質(zhì)積聚，阻止抑制脂肪酸氧化，對人類(lèi)乙醇性脂肪變性、炎癥和肝損傷有潛在治療作用［15］。生脂基因激活、肝細胞中脂質(zhì)積聚是通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，NR3C1）的反式激活和N6-甲基腺苷去甲基化來(lái)減少脂質(zhì)積聚的，可以防止肝臟脂肪變性［16］。減少脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）含量及活性是預防乙醇性肝損傷及保護肝臟的關(guān)鍵［17］。因此，從NT5E、REN、ADORA2A、EGFR、MTOR、NR3C1以及FASN這些靶點(diǎn)的研究結果可以推測：多年生白首烏活性成分是通過(guò)影響基因表達及能量代謝途徑來(lái)達到保護肝臟的功能。

非乙醇性脂肪肝病和糖尿病與肝臟細胞色素P450 3A4（cytochrome P450 3A4，CYP3A4）活性降低有關(guān)，通過(guò)抑制CYP3A4酶含量對肝損傷具有保護作用［18］。植物提取物對肝臟有一定的保護作用，研究發(fā)現，白細胞介素-6（interleukin-6，IL6）就是通過(guò)減輕炎癥反應來(lái)減少肝臟脂肪變性和肝細胞壞死的靶點(diǎn)之一，通過(guò)減輕炎癥反應和氧化應激可以保護肝臟，預防乙醇性肝損傷［19-20］。通過(guò)對CYP3A4、IL6這2個(gè)靶點(diǎn)的研究，推測一年生白首烏中的成分是通過(guò)減少細胞色素的活性及減輕炎癥反應來(lái)抑制乙醇性肝損傷及相關(guān)疾病。分子對接的可視化結果顯示，通過(guò)分子之間的相互對接驗證了上述靶點(diǎn)確實(shí)對乙醇性肝損傷起到了重要作用。

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