癌相關(guān)成纖維細胞外泌體通過(guò)抑制鐵死亡促進(jìn)前列癌惡性侵襲

趙軍, 毛亮, 沈繼杰, 孫宏斌

鐵死亡是一種鐵依賴(lài)性細胞死亡模式,特征改變是脂質(zhì)過(guò)氧化導致活性氧(reactive oxygen species,ROS)大量累積及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(GPX4)的失活,機制特征不同于細胞凋亡等其他細胞死亡方式。GPX4是鐵死亡關(guān)鍵調控蛋白[1], 在前列腺癌中呈高表達[2]。下調其表達可引發(fā)腫瘤細胞鐵死亡,是腫瘤治療中區別于傳統療法的新策略,已引起臨床極大關(guān)注。多個(gè)研究發(fā)現microRNA-15a、microRNA-214-3p等小分子mRNA抑制物參與調控前列腺癌鐵死亡[3-4]。癌相關(guān)成纖維細胞(CAFs)是腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細胞的主要成分,可通過(guò)傳遞外泌體miR-522抑制鐵死亡促進(jìn)胃癌化療耐藥[5]。在前列腺癌中,CAFs與GPX4高表達及與鐵死亡的關(guān)聯(lián)性還未可知。課題組前期已經(jīng)報道CAFs在體外和體內實(shí)驗條件下可顯著(zhù)促進(jìn)前列腺癌細胞增值和侵襲[6],本研究擬觀(guān)察CAFs來(lái)源的外泌體(CAFs-exo)是否通過(guò)調控前列腺癌鐵死亡促發(fā)前列腺癌細胞增殖和遷移。

1.1 一般資料

1.1.1 細胞 人前列腺癌細胞株22rv1和PC-3 購自中國科學(xué)院細胞庫。前列腺癌新鮮組織取自南京市第一醫院泌尿外科行前列腺癌根治術(shù)患者,由病理科醫生確診取材,獲得富含腫瘤區域的癌組織及癌旁組織,本研究經(jīng)倫理委員會(huì )批準,獲患者知情同意。

1.1.2 主要試劑及儀器 1640培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購均自美國Gibco公司;無(wú)外泌體血清購自美國System Bioscience公司;腫瘤組織解離液購自德國Miltenyi公司;Transwell小室、Mgtrigel 基質(zhì)膠購自美國Corning公司;α-SMA、FSP-1、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Actin、NFR2、ACSL4、GPX4、GAPDH一抗購自中國Proteintech公司,FAP一抗購自美國Cell Signaling Technology公司,IgG二抗購自中國B(niǎo)iosharp公司;鐵死亡誘導劑Erastin購自美國Medcheemexpress公司;ROS檢測試劑盒、細胞死亡PI檢測試劑盒購自中國KeyGEN 公司;線(xiàn)粒體膜電位(mitochondrial membrane potentia,MMP)檢測試劑盒購自中國 Beyotime公司;DxFLEX流式細胞儀、超速離心機、酶標儀購自德國,BECKMAN公司;熒光顯微鏡購自德國Zeiss公司;Western blot電泳儀購自中國Tanon公司。

1.2 細胞培養和鑒定

1.2.1 CAFs和NFs培養 按課題組已建立的方法[6],收集前列腺癌癌組織和癌旁新鮮組織,無(wú)菌PBS液沖洗2次,于超凈臺中將組織樣本剪碎至2 mm大小,組織解離液消化30 min,1 000rpm離心5 min,棄上清,加入含有10%胎牛血清的1640培養基中重新懸浮,并傳遞到培養皿中,洗去組織碎片和沒(méi)有貼壁的細胞,每3～4 d更換培養液傳代1次,取第二代到第六代細胞進(jìn)行實(shí)驗研究。

1.2.2 CAFs和NFs表型鑒定 免疫熒光和Western blot檢測NFs和CAFs中α-SMA、FAP和FSP-1蛋白表達水平。免疫熒光實(shí)驗步驟為:將細胞接種到24孔板,貼壁后4%多聚甲醛固定15 min,1% TritonX-100冰上通透15 min,加入5%的BSA溶液(含有0.2% TritonX-100)37 ℃封閉1 h,加入1∶200的α-SMA、FSP-1、FAP一抗,4 ℃孵育過(guò)夜,然后用TBST洗3次,然后加入稀釋好的熒光二抗,37 ℃孵育1.5 h,TBST洗3次后,取出細胞爬片置于載玻片上用DAPI染細胞核,在熒光顯微鏡下觀(guān)察熒光強度。

1.2.3 前列腺癌細胞培養 取液氮中保存的前列腺癌細胞22rv1和PC-3,于37 ℃水浴鍋中迅速解凍,加入完全培養基中和凍存液,1 000 rpm離心5 min,棄去上清,加入含有10%血清的1640完全培養基,吹打混勻后,加入培養瓶中,置于培養箱中培養。

1.3 外泌體提取和鑒定

1.3.1 外泌體提取 超速離心法提取外泌體。使用無(wú)外泌體血清培養CAFs和NFs,收集上清液,在10 000 g下離心30 min去除碎片,然后在超速離心機110 000 g下離心120 min,棄去上清液,從沉淀物中收集外泌體并重新懸浮在PBS中,置-80 ℃冰箱保存。所有步驟均在4 ℃環(huán)境下進(jìn)行。

1.3.2 外泌體鑒定 ①Western blot檢測TSG101、CD63、CD9蛋白表達;②透射電鏡:將外泌體置7.2%戊二醛液4 ℃固定過(guò)夜,PBS液沖洗后置1%四氧化鋨室溫固定60 min,包埋于10%明膠,戊二醛固定后切成<1 mm3小塊。按酒精梯隊脫水(酒精濃度分別為30%,50%,70%,90%,95%和100%),環(huán)氧丙烷交換純醇,Quetol-812環(huán)氧樹(shù)脂(濃度分別為25%,50%,75%和100%)與環(huán)氧丙烷混合浸潤標本,包埋并聚合(35 ℃ 12 h,45 ℃ 12 h,60 ℃ 24 h)。徠卡UC100切片機切割超薄切片(6 nm),經(jīng)乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色后在FEI Tecnai T20透射電鏡中觀(guān)察外泌體形態(tài);③納米顆粒跟蹤技術(shù)(nanoparticle tracking analysis,NTA):將外泌體以5 mg/L的濃度重懸于PBS中,進(jìn)一步將懸液稀釋100～500倍。在環(huán)境溫度下手動(dòng)將樣品注入樣品室。每個(gè)樣品都配置有488 nm激光器和高靈敏度sCMOS相機,通過(guò)收集納米顆粒散射光信號,拍攝一段納米顆粒在溶液中做布朗運動(dòng)的影像,對每個(gè)顆粒的布朗運動(dòng)進(jìn)行追蹤。最后,使用NTA分析軟件計算出外泌體的半徑和濃度。

1.4 細胞遷移和侵襲實(shí)驗

用不含血清的1640培養基稀釋22rv1和PC-3細胞,接種至Transwell小室,加入100 μL基質(zhì)膠和培養基的混合物(比例1∶7),置37 ℃恒溫培養并凝固2 h,每個(gè)小室加入1×105個(gè)細胞懸液200 μL,每組分別加入PBS、CAFs-exo和NFs-exo,外泌體終濃度為10 mg/L,將小室放入24孔板中,每孔加入600 μl含有1 μmol/L Erastin 的1640完全培養基,置37 ℃恒溫培養箱24 h。PBS清洗,4%多聚甲醛固定Transwell小室15 min,結晶紫染色15 min,PBS液清洗,倒置顯微鏡下觀(guān)察拍照,image J軟件分析比較各組細胞遷移以及侵襲的細胞數并統計分析。

1.5 細胞劃痕實(shí)驗

在6孔板中接種22rv1和PC-3細胞,待細胞生長(cháng)匯合至90%,用10 μL槍頭配合直尺在每孔單層細胞上豎痕,使細胞形成傷口模型,PBS清洗兩遍去除劃痕處細胞,在顯微鏡下觀(guān)察并拍照記作0 h,加入含有1 μmol/L Erastin的1640培養基,每組分別加入PBS、CAFs-exo、NFs-exo,外泌體濃度為10 mg/L,24 h后在顯微鏡下觀(guān)察細胞劃痕的愈合程度并拍照。

1.6 平板克隆實(shí)驗

將約500個(gè)22rv1和PC-3細胞接種到6孔板中,37 ℃恒溫培養2周。去除培養液,PBS清洗,加入4%多聚甲醛固定細胞,加入結晶紫染色,觀(guān)察細胞菌落數量并拍照。

1.7 ROS水平、細胞死亡、線(xiàn)粒體膜電位檢測:評估細胞鐵死亡相關(guān)指標

1.7.1 ROS水平檢測 按ROS檢測試劑盒步驟進(jìn)行。所檢測的細胞數<5×105/ml,去除培養液,加入含有10 μmol/L DCFH-DA的無(wú)血清培養液,在37 ℃避光的細胞培養箱中培養30 min。使用激發(fā)波長(cháng)488 nm和發(fā)射波長(cháng)525 nm測量熒光,每組的平均熒光強度表示細胞內ROS的量。

1.7.2 細胞死亡檢測 將細胞均勻地生長(cháng)在12孔板中,10 μmol/L Erastin處理后收集細胞,重新懸浮在流管中(50 000個(gè)細胞/管),與2 μL的PI試劑孵化10 min,流式細胞儀分析死亡細胞情況。

1.7.3 線(xiàn)粒體膜電位(MMP)檢測 將細胞均勻地生長(cháng)在6孔板中,按照試劑商說(shuō)明用適量的TMRE工作液孵育15 min,用PBS去除殘留的TMRE,收集標記的細胞,通過(guò)熒光信號的強弱來(lái)檢測MMP的變化,MMP降低熒光強度減弱。使用酶標儀檢測細胞熒光強度,其激發(fā)波長(cháng)為550 nm,發(fā)射波長(cháng)為575 nm。

1.8 Western blot實(shí)驗 胰蛋白酶消化細胞后離心,RIPA裂解液提取細胞總蛋白,BCA法測量蛋白濃度。加入SDS上樣緩沖液,100 ℃水浴中煮沸15 min,蛋白充分變性后將樣品上樣到SDS-PAGE凝膠中電泳,轉PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉膜2 h,加入1∶2 000一抗稀釋液4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜3次后,加入1∶5 000稀釋的二抗在搖床上室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,每次15 min,配置化學(xué)發(fā)光液,曝光機下曝光。

1.9 統計學(xué)分析

2.1 CAFs原代培養及表型鑒定

CAFs和NFs均陽(yáng)性表達特征蛋白α-SMA、FAP和FSP-1,但CAFs熒光染色強度(圖1)及蛋白表達量(圖2)均高于NFs。

圖1 免疫熒光鑒定NFs和CAFs的結果 細胞呈長(cháng)梭形或不規則三角形,放射狀生長(cháng),細胞鋪滿(mǎn)瓶底后相互交織,細胞間幾乎沒(méi)有間隙,CAFs和NFs均陽(yáng)性表達特征蛋白α-SMA、FAP和FSP-1,CAFs中α-SMA、FAP以及FSP1的熒光強度高于NFs,比例尺為50 μm

圖2 Western blot鑒定NFs和CAFs表面標記物α-SMA、FAP、FSP-1表達 CAFs中α-SMA、FAP以及FSP-1的蛋白表達量均高于NFs

2.2 外泌體鑒定

CAFs-exo和NFs-exo均呈典型的球形膜狀結構(圖3),粒徑大多為30～150 nm(圖4),Western blot檢測示特征性蛋白CD9、CD63、TSG101均表達陽(yáng)性(圖5)。

圖3 透射電子顯微鏡下外泌體的形態(tài) NFs(3A)和CAFs(3B)的外泌體形態(tài)都呈球形膜狀結構,比例尺為100 nm

圖4 納米顆粒跟蹤分析外泌體的直徑

圖5 Western blot檢測NFs和CAFs外泌體的表面標志蛋白 NFs和CAFs的外泌體均表達TSG101、CD63和CD9標志蛋白

2.3 CAFs-exo抑制Erastin誘導的鐵死亡

用鐵死亡誘導劑Erastin分別處理前列腺癌細胞22rv1和PC-3,相比于未處理的對照組癌細胞,均呈現鐵死亡特征改變,ROS水平升高(P<0.001)、細胞死亡數目增加(P<0.001),線(xiàn)粒體膜電位下降(P<0.001)(圖6)。分別予CAFs-exo和NFs-exo共培養處理細胞, NFs-exo組相較于 Erastin組,ROS水平、細胞死亡率以及線(xiàn)粒體膜電位,差異均無(wú)統計學(xué)意義(P>0.05);而CAFs-exo組相較于 Erastin組和NFs-exo組,ROS水平下降(P<0.001),細胞死亡率下降(P<0.001),膜電位水平升高(P<0.01)(圖6)。

注: **為P<0.01;***P<0.001,#為P>0.05

Western blot顯示, NFs-exo組相較于Erastin組,NRF2、ACSL4和GPX4蛋白表達水平差異無(wú)統計學(xué)意義(P>0.05);而CAFs-exo組相較于 Erastin組和NFs-exo組,NRF2表達水平降低(P<0.05),ACSL4表達水平降低(P<0.01),GPX4表達水平升高(P<0.01)(圖7)。

注:*為 P<0.05,**為 P<0.01,#為P>0.05

2.4 CAFs-exo抑制鐵死亡促進(jìn)細胞增殖和遷移

Transwell實(shí)驗示,以Erastin組為參照,加入CAFs-exo、NFs-exo共培養后,NFs-exo組相較于Erastin組,前列腺癌細胞22rv1和PC-3的遷移、侵襲以及克隆形成數,差異無(wú)統計學(xué)意義(P>0.05)(圖8～10)。CAFs-exo組相較于Erastin組和NFs-exo組,可促進(jìn)前列腺癌細胞的遷移(P<0.001)和侵襲(P<0.001)(圖8),細胞遷移能力增加(P<0.01)(圖9),細胞克隆形成數增加(P<0.01)(圖10)。

注:比例尺為100 μm;**為P<0.01,***為 P<0.001,#為P>0.05

注:比例尺為 100 μm;*為 P<0.05,**為 P<0.01,#為P>0.05

注:**P<0.01;#為P>0.05

2.5 CAFs-exo抑制鐵死亡促進(jìn)上皮間質(zhì)轉化

用CAFs-exo和NFs-exo分別處理前列腺癌細胞細胞22rv1和PC-3,CAFs-exo組EMT轉化增強,呈現E-cadherin表達水平下降(P<0.01),N-cadherin表達水平增高(P<0.001)、β-catenin表達水平增高(P<0.05)和Vimentin表達水平增高(P<0.001),而NFs-exo組蛋白水平變化,差異無(wú)統計學(xué)意義(P>0.05)(圖11)。

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,#為P>0.05

鐵死亡是鐵依賴(lài)可調節性細胞死亡模式,機制特征和細胞凋亡不同。GPX4是谷胱甘肽合成酶的關(guān)鍵酶,可通過(guò)減少脂質(zhì)過(guò)氧化負調控腫瘤細胞鐵死亡,發(fā)揮促癌作用。最近的研究表明,鐵死亡與前列腺癌病因機制有關(guān),microRNA-214-3p、microRNA-324-3p等一些小分子miRNA被證實(shí)可靶向調控GPX4誘發(fā)前列腺癌細胞鐵死亡發(fā)揮抗癌作用[4,7],已成為前列腺癌治療的一種可行方案。

CAFs是腫瘤微環(huán)境中最重要的基質(zhì)細胞,可通過(guò)傳遞核酸、蛋白質(zhì)等信號分子調控腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。文獻報道,CAFs來(lái)源的外泌體可增加Snail表達促進(jìn)胰腺癌細胞增殖并誘導吉西他濱耐藥[8];在結腸癌中,CAFs外泌體可增強癌細胞干性和上皮-間質(zhì)轉化促進(jìn)結腸癌細胞的轉移和化療耐藥[9]。對前列腺癌的研究表明,CAFs外泌體miR-423-5p可通過(guò)調控TGF-β信號通路靶向GREM2促進(jìn)前列腺癌化療耐藥[10],但CAFs外泌體對前列腺癌鐵死亡的影響及與GPX4高表達的關(guān)聯(lián)性還未可知。

本研究成功分離并原代培養癌組織CAFs和癌旁基質(zhì)NFs,經(jīng)免疫熒光實(shí)驗和Western blot證實(shí)CAFs較NFs高表達α-SMA、FAP和FSP-1特征蛋白;通過(guò)超高速離心法分別提取出CAFs-exo和NFs-exo,再分別將CAFs-exo、NFs-exo和Erastin誘導后的22rv1和PC-3細胞共培養。研究發(fā)現,Erastin可誘導22rv1和PC-3細胞出現鐵死亡的特征,表現為細胞內ROS累積、細胞死亡數量增加以及線(xiàn)粒體膜電位的下降。經(jīng)CAFs-exo共培養處理后,CAFs-exo呈現出顯著(zhù)抑制Erastin導致的細胞內脂質(zhì)ROS累積并部分逆轉線(xiàn)粒體膜電位水平的作用,同時(shí)細胞死亡率明顯減少;Western blot發(fā)現鐵死亡調控蛋白GPX4表達增高而NRF2、ACSL4水平下調,顯示源于CAFs的外泌體可通過(guò)調控鐵死亡機制發(fā)揮促進(jìn)癌細胞增值的作用,該作用也顯現出22rv1和PC-3細胞遷移以及侵襲能力的增強。本研究結果證實(shí)CAFs來(lái)源的外泌體確實(shí)可通過(guò)抑制細胞鐵死亡的機制在前列腺癌疾病進(jìn)展中發(fā)揮調控作用,而NFs-exo對此無(wú)明顯影響。

Wnt/β-catenin信號通路是促進(jìn)腫瘤上皮-間質(zhì)轉化進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的主要原因,在多種惡性實(shí)體瘤中被發(fā)現有異常激活。研究表明,LncRNA GHET1可調節AKT/mTOR和Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)宮頸癌臨床進(jìn)展[11]。在前列腺癌中,SIRT3可通過(guò)Wnt/β-catenin信號通路調控前列腺癌細胞侵襲和轉移[12]。本研究發(fā)現CAFs來(lái)源的外泌體與Erastin誘導后的22rv1細胞共培養,以Erastin為對照,22rv1細胞呈現E-cadherin表達水平下調而N-cadherin、β-catenin、Vimentin水平上調的現象,NFs外泌體對此無(wú)顯著(zhù)影響。E-cadherin水平的下調顯著(zhù)增加癌細胞侵襲能力[13],表明CAFs-exo可通過(guò)抑制鐵死亡機制促進(jìn)前列腺癌細胞增強EMT及轉移能力。

綜上所述,本研究初步證實(shí)CAFs分泌的外泌體可通過(guò)抑制鐵死亡促進(jìn)前列腺癌細胞增殖、遷移和上皮-間質(zhì)轉化,是前列腺癌進(jìn)展的重要調控機制。但具體是何種外泌體通過(guò)何種物質(zhì)發(fā)揮調控作用需進(jìn)一步分子測序和功能研究。