人血清中福氏2a及宋內志賀菌O-特異性多糖抗體IgG含量間接ELISA定量檢測方法的驗證及應用

李紅，石剛，郭麗娜，陳瓊，付宏斌，王國東，胡小華，朱衛華，王斌，葉強

1.中國食品藥品檢定研究院衛生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標準化重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 102629；
2.北京智飛綠竹生物制藥有限公司，北京 100176

志賀菌屬（Shigella）是引發(fā)細菌性痢疾的主要致病菌［1］，可分為4 個(gè)血清群（serotype），包括A 群痢疾志賀菌、B 群福氏志賀菌、C 群鮑氏志賀菌和D 群宋內志賀菌［2-6］。福氏志賀菌在發(fā)展中國家呈地方性流行，也是全球最常見(jiàn)的分離株，包括2a、3a、5b等16個(gè)亞型［3］，其中2a型是我國流行的主要型別［7］。在美國和其他高度工業(yè)化國家，宋內志賀菌是優(yōu)勢菌株［8-9］。我國痢疾發(fā)病率較高［7，10-12］，尤其在出現抗生素耐藥株后，其發(fā)病率位居39種傳染病前5位［13-16］。

痢疾疫苗的研究和使用可追溯至1903 年，但目前仍無(wú)理想的痢疾疫苗上市［17-18］。O-特異性多糖鏈（O-specific polysaccharide chain）簡(jiǎn)稱(chēng)O抗原，是志賀菌重要的保護性抗原之一，目前研究較多的是用生化方法提取O 抗原后與蛋白載體結合，制成多糖-蛋白結合疫苗［19-20］，接種人體后可產(chǎn)生特異性IgG，對志賀菌引起的疾病具有保護作用。檢測人血清中IgG抗體的含量是評價(jià)該疫苗免疫應答水平的重要手段。本研究按照間接ELISA 法的建立及驗證要求，對企業(yè)提供方法的準確性、精密性及特異性等方面進(jìn)行驗證［21-22］，并進(jìn)行初步應用。

1.1 多糖及血清 福氏2a 及宋內志賀菌O-特異性多糖（分別簡(jiǎn)稱(chēng)福氏2a 多糖及宋內多糖）、參考血清（血清08，賦值為100 EU／mL）、質(zhì)控血清（血清96）及福氏宋內痢疾雙價(jià)疫苗免疫前后1 842 份人血清樣本均由北京智飛綠竹生物制藥有限公司提供。

1.2 主要試劑 堿性磷酸酶標記羊抗人IgG（貨號：A3187）及磷酸-4-硝基苯酯二鈉鹽（4-Nitrophenyl phosphatedisodium salthexahydratepNPPdisodium salthexahydrate，PNPP）（貨號：P4744）均購自美國Sigma-aldrich公司；
牛血清白蛋白購自德國默克公司；
PBST 購自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司。

1.3 檢測方法 將福氏2a及宋內多糖分別按10 μg／mL濃度包被96 孔板，100 μL／孔，4 ℃包被過(guò)夜；
洗液（含0.05%吐溫的生理鹽水）洗滌2 次，用含4%牛血清白蛋白的PBST 于37 ℃封閉1 ～2 h；
加入待測血清（1∶10稀釋?zhuān)?00 μL／孔，37 ℃作用2 h；
洗液洗滌3次，加入堿性磷酸酶標記羊抗人IgG（1∶40 000 稀釋?zhuān)?00 μL／孔，37 ℃孵育2 h；
洗液洗滌3 次，加入PNPP 溶液，100 μL／孔，37 ℃孵育2 h；
用3 mol／L氫氧化鈉終止反應，用酶標儀檢測A405及A690。采用四參數法繪制參考血清的標準曲線(xiàn)，計算每份血清福氏2a和宋內多糖抗體IgG含量。

1.4 方法的驗證

1.4.1 準確性 將參考血清及質(zhì)控血清按一定比例混合（見(jiàn)表1），制備成10 份不同濃度的血清樣本，編號為S1 ～S10，按1.3 項方法連續檢測6 d，并按下式計算抗體回收率。

表1 參考血清與質(zhì)控血清的混合比例（%）Tab.1 Mixing ratio of reference serum and quality control serum（%）

1.4.2 精密性

1.4.2.1 試驗內精密性 將1.4.1 項中制備的血清樣本S10 及QC 按1.3 項方法連續檢測6 d，每天重復檢測3次，計算每天每份樣本3次檢測結果的CV。

1.4.2.2 試驗間精密性 將1.4.1 項中制備的S1 ～S10 血清樣本及質(zhì)控血清（編號為QC）按1.3 項方法連續檢測6 d，計算每份樣本6 次檢測結果的變異系數（coefficient of variation，CV）。

1.4.3 特異性 將福氏2a 及宋內多糖分別稀釋至400 μg／mL，等體積分數混合后，再與參考血清（1∶100 稀釋?zhuān)┌吹润w積分數混合，置37 ℃孵育2 h，以該血清作為陰性血清。將福氏2a和宋內多糖分別稀釋至200、100、40、10、4、1、0.4、0.2、0.1、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.000 1、0 μg／mL，分別與參考血清及陰性血清（均1∶100 稀釋?zhuān)┌吹润w積分數混合，將混合血清置37 ℃孵育2 h，酶標儀檢測A405，并按下式計算抑制率。以多糖濃度的對數值為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制抑制曲線(xiàn)。

1.4.4 線(xiàn)性范圍 按1.3 項方法檢測參考血清，以抗體含量為橫坐標，A405為縱坐標，繪制標準曲線(xiàn)，獲得曲線(xiàn)方程，計算相關(guān)系數（R2）。

1.4.5 定量限（limit of quantitation，LOQ） 將1.4.1項中制備的S1 ～S10 血清樣本按1.3 項方法連續檢測6 d，計算多糖抗體IgG 回收率及其CV，回收率計算公式同1.4.1 項。以回收率CV低于20%的相應參考血清含量作為方法的LOQ。

1.5 方法的應用 采用驗證的方法檢測福氏宋內痢疾雙價(jià)疫苗免疫前后的1 842份血清樣本。

1.6 數據整理與分析 應用SoftmaxPro 5.4.1軟件進(jìn)行整理數據及作圖。

2.1 方法的驗證

2.1.1 準確性 10 份血清樣本中福氏2a 多糖抗體IgG含量為97.10～109.82EU／mL，回收率為73.21%～222.68%，除S1外均在60%～140%范圍內；
宋內多糖抗體IgG 含量為32.07 ～62.17 EU／mL，回收率為83.67%～123.56%，均在60%～140%范圍內。見(jiàn)表2。表明該方法具有良好的準確性。

表2 準確性驗證結果（n=6）Tab.2 Verification for accuracy（n=6）

2.1.2 精密性

2.1.2.1 試驗內精密性 連續6 d，每天3次檢測10份血清樣本，福氏2a多糖抗體IgG含量的CV為0.06%～9.92%，宋內多糖抗體IgG 含 量 的CV為0.63% ～3.91%，均＜30%，見(jiàn)表3。表明該方法具有良好的試驗內精密性。

表3 試驗內精密性驗證結果（n=3）Tab.3 Verification for precision within tests（n=3）

2.1.2.2 試驗間精密性 連續6 d 檢測10 份血清樣本福氏2a多糖抗體IgG含量的CV為3.09%～9.10%，宋內多糖抗體IgG 含量的CV為3.85% ～11.88%，均＜30%，見(jiàn)表4。表明該方法具有良好的試驗間精密性。

表4 試驗間精密性驗證結果（n=6）Tab.4 Verification for precision between tests（n=6）

2.1.3 特異性 隨著(zhù)吸收多糖濃度的增高，參考血清的抑制率增加，陰性血清增加不明顯。福氏2a多糖吸收濃度達100 μg／mL時(shí)，參考血清抑制率達85.95%，陰性血清抑制率為2.89%；
福氏2a多糖吸收濃度為5×10-5μg／mL時(shí)，參考血清抑制率達-0.61%，陰性血清抑制率為14.97%。宋內多糖吸收濃度達100 μg／mL時(shí)，參考血清抑制率達88.42%，陰性血清抑制率為1.65%；
宋內多糖吸收濃度達5 × 10-5μg／mL 時(shí)，參考血清抑制率達1.04%，陰性血清抑制率為6.71%。見(jiàn)圖1。表明兩種多糖與血清可發(fā)生特異性反應。

圖1 多糖抗原對血清抗體的抑制曲線(xiàn)Fig.1 Inhibition curve of polysaccharide antigen on serum antibody

2.1.4 線(xiàn)性范圍 兩種多糖抗體IgG含量間接ELISA檢測標準曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。福氏2a 多糖抗體IgG 含量在0.05 ～0.125 EU／mL 范圍內，與A405呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為Y=（-0.032 3-9.97）／［1+（X／0.501）0.822］+9.97，R2≥0.99；
宋內多糖抗體IgG含量在0.025 ～0.125 EU／mL 范圍內，與A405呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為Y=（-0.005 51-4.79）／［1+（X／0.078 2）0.978］+4.79，R2≥0.99。

圖2 血清多糖抗體含量間接ELISA檢測標準曲線(xiàn)Fig.2 Standard curve of indirect ELISA for detection of serum polysaccharide antibody content

2.1.5 LOQ 福氏2a和宋內多糖抗體IgG檢測的LOQ分別為0.05和0.025 EU／mL。見(jiàn)表5。

表5 福氏2a及宋內多糖抗體IgG含量檢測IOQ的確定（%）Tab.5 LOQ for detection of IgG content of flexneri 2a and sonnei polysaccharide antibody（%）

2.2 方法的應用 福氏宋內痢疾雙價(jià)疫苗免疫前血清樣本中，福氏2a多糖抗體IgG含量為0.18～0.48EU／nL，宋內多糖抗體IgG 含量為0.08～0.43 EU／mL；
免疫后血清樣本中福氏2a多糖抗體IgG 含量為2.59～17.03 EU／mL，宋內多糖抗體IgG 含量為5.38～16.64 EU／mL。免疫后血清中抗體IgG 含量大幅高于免疫前。

目前，評估痢疾疫苗臨床效果的主要檢測手段為ELISA 法檢測血清中的抗體滴度，該方法由北京智飛綠竹生物制藥有限公司建立，于中國食品藥品檢定研究院細菌多糖和結合疫苗室進(jìn)行了準確性、精密性和特異性等方面驗證。定量限驗證結果顯示，S1 ～S10 血清樣本中S1、S2、S3 及S7 的福氏2a 多糖抗體IgG 回收率CV均＞20%，以S2 為例，6 次測定的平均回收率為73.21%，但回收率CV為96.56%，表明此時(shí)無(wú)法穩定檢測出S2 血清內參考血清的抗體IgG含量，即該濃度抗體無(wú)法準確定量；
當回收率CV較低時(shí)，該血清內所含參考血清的抗體才可準確定量［7］。因此，以回收率CV低于20%的參考血清抗體含量作為該方法的定量限，福氏2a 和宋內多糖抗體IgG 檢測的定量限分別為0.05 和0.025 EU／mL。在福氏2a 的回收率均值中，S7 的回收率CV大于20%，初步分析應為偶然誤差，今后將通過(guò)增加檢測次數來(lái)驗證該結果的準確性。

準確性驗證結果顯示,福氏2a 和宋內多糖血清IgG 回收率分別為90.58% ～132.43%和83.67% ～106.13%，表明方法準確性較高；
精密性驗證結果顯示，試驗間CV分別為3.09% ～9.10%和3.85% ～11.88%，試驗內CV分別為0.06%～9.92%和0.63%～3.91%，表明方法具有良好的精密性；
特異性驗證結果顯示，在競爭抑制ELISA 中，隨著(zhù)多糖吸收濃度的增高，參考血清對福氏2a多糖的抑制率從-0.61%升至85.95%，對宋內多糖的抑制率從1.04% 升至88.42%，表明兩種多糖與血清可發(fā)生特異性反應。綜上所述，該方法可滿(mǎn)足痢疾疫苗臨床血清抗體定量檢測的要求。

目前，國內外的痢疾疫苗臨床血清免疫原性檢測中，仍以半定量法為主，即用血清抗體水平滴度表示［23-25］，無(wú)法準確檢測出血清的抗體水平，急需建立定量檢測方法，才能更準確描述機體的免疫水平和免疫狀態(tài)。本研究檢測中所用的參考血清抗體值仍采用賦值的方式，對于定量檢測方法仍是一個(gè)缺陷，但國際尚無(wú)已定值的參考血清，需采用其他方法來(lái)進(jìn)行參考血清抗體值的首次定量，這也是今后的研究需要解決的問(wèn)題。