外生菌根真菌多樣性對云杉根際土壤生化性質(zhì)的影響

張晨洋，付雙嘉，高浩英，王麗霞

（四川農業(yè)大學(xué)林學(xué)院/長(cháng)江上游林業(yè)生態(tài)工程四川省重點(diǎn)實(shí)驗室，成都 611130）

外生菌根（ectomycorrhizas, ECM）是高等植物根系與真菌形成的互惠共生體，它可通過(guò)菌絲擴大吸收面積或通過(guò)分泌有機酸風(fēng)化原生礦物、分泌胞外酶活化有機質(zhì)中固定的氮磷養分，從而增強宿主植物對養分的吸收[1-5]。ECM真菌具有豐富的多樣性，不同種類(lèi)或基因型的菌根真菌在生理特征、侵染程度、菌絲生長(cháng)速度、分泌有機酸及胞外酶能力和類(lèi)型上存在顯著(zhù)差異[6-7]，例如K. Stuart 等[6]研究發(fā)現ECM 真菌Pisolithus albus和Pisolithus microcarpus可能由于分泌磷活化酶不同導致兩者活化磷能力存在差異。此外也有研究發(fā)現[8]，雙色蠟蘑（Laccaria bicolor）、紅褐乳菇（Lactarius rufus）和肝螺乳菇（Lactarius hepalicus）3 種不同類(lèi)型的真菌對銨鹽的吸收能力也明顯的不同。上述菌根真菌種間差異導致菌根真菌之間出現生態(tài)位互補、競爭、促進(jìn)和選擇效應[7,9-11]。例如L. M. Jonsson等[10]的研究發(fā)現，由于宿主植物及土壤環(huán)境等對ECM真菌的選擇作用，導致在ECM真菌群落中僅少數幾種ECM真菌占據優(yōu)勢地位，從而與其他ECM真菌在土壤資源利用方面產(chǎn)生競爭作用，進(jìn)而抑制了其他菌根真菌的繁殖及功能發(fā)揮。其次，關(guān)于菌根真菌物種間的互補作用，隨宿主植物根系侵染的ECM 真菌種類(lèi)的增多，能夠分泌的有機酸和胞外酶等種類(lèi)也將增多，其服務(wù)宿主植物吸收利用土壤養分的能力也將進(jìn)一步增強。因此具有較高多樣性的菌根真菌群落和其群落內的個(gè)體差異可能對寄主生長(cháng)和營(yíng)養獲取有重要的影響[11]。且這些種內和種間效應也是支撐生物多樣性-生態(tài)系統功能關(guān)系的主要機制，同時(shí)也賦予了生態(tài)系統應對環(huán)境變化的絕佳恢復力[12-13]。因此，研究外生菌根真菌的種內和種間多樣性對生態(tài)系統功能的維持和提升有重要的作用[14-15]。目前對ECM真菌多樣性的研究，主要集中在氣候變化及環(huán)境因子對ECM真菌多樣性的影響[16-18]，以及ECM真菌豐度、豐富度、侵染率等對植物養分吸收及生長(cháng)的影響[19-21]。關(guān)于ECM 真菌接種的研究較少，且接種試驗研究多集中于單一ECM 真菌種類(lèi)對植物生物量及生長(cháng)特征的影響，或接種ECM真菌對提高宿主抗逆性的研究[21-24]。而關(guān)于不同多樣性的ECM真菌接種對植物根際土壤生化性質(zhì)影響的研究相對缺乏[25]。云杉（Picea asperata Mast.）隸屬于松科云杉屬，為四川亞高山區重要組成樹(shù)種。近些年來(lái)，由于人類(lèi)活動(dòng)的影響，造成川西森林生態(tài)系統嚴重退化。雖然在原始林中進(jìn)行了大規模的人工造林（已成為該區森林的重要組成部分），但是由于物種單一，生態(tài)功能難以恢復。因此導致該區域環(huán)境惡化、生物多樣性銳減，森林生態(tài)逆向演替明顯，因此加強恢復亞高山人工針葉林退化生態(tài)系統和生態(tài)功能，使其能夠持續天然更新是當前面臨的主要任務(wù)。而目前關(guān)于川西人工林天然更新的研究還主要集中于林窗形成對云杉種子萌發(fā)的影響[26]；
粗枝云杉的土壤微生物生物量碳、氮及功能群組成分析[27]；
以及云杉人工林分結構調控下植物與土壤動(dòng)物多樣性的調查等[28]。而在亞高山人工針葉林的生態(tài)恢復過(guò)程中，有重要調控作用的地下菌根真菌多樣性還缺乏系統深入的認識。有大量研究表明宿主植物多樣性與外生菌根真菌多樣性呈顯著(zhù)正相關(guān)關(guān)系[29]，同時(shí)我們在調查川西亞高山云杉人工林和天然林時(shí)發(fā)現，天然林的外生菌根真菌群落多樣性要顯著(zhù)高于云杉人工林?；谏鲜鲅芯亢驼{查結果，針對川西亞高山人工針葉林在天然更新中所面臨的土壤生態(tài)問(wèn)題，我們提出川西亞高山人工林是不是由于地上宿主單一導致地下菌根真菌多樣性低進(jìn)而減緩土壤有機質(zhì)分解而導致較低的土壤養分有效性？因此本文通過(guò)野外實(shí)踐調查菌根真菌多樣性與川西亞高山森林生物多樣性之間的相關(guān)關(guān)系，確定對川西亞高山人工針葉林有重要影響的外生菌根真菌種類(lèi)及組合，然后以川西亞高山人工針葉林主要樹(shù)種云杉為研究對象，通過(guò)室內育苗培養，接種5 種多樣性梯度的外生菌根真菌（對照、1、2、4和8種外生菌根真菌），并定期對土壤pH、含水率、總有機碳、可溶性有機碳、有機質(zhì)、全氮（土壤中所有氮素含量）、可溶性全氮（穩定態(tài)有機氮與無(wú)機氮的中間產(chǎn)物）、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、無(wú)機氮（硝態(tài)氮和銨態(tài)氮之和）、全磷、微生物生物量碳和微生物生物量氮等物理生化性質(zhì)進(jìn)行測定，進(jìn)而深入闡述地下菌根真菌多樣性對土壤生化性質(zhì)的影響機制。為菌根真菌多樣性在川西亞高山人工針葉林土壤生態(tài)功能中的作用提供數據支撐。

1.1 土壤、外生菌根真菌子實(shí)體和云杉種子采集

于2019 年9 月初在四川省阿壩州理縣米亞羅自然保護區人工云杉林（103°21＇E，31°40＇N）采集土壤（厚度約為15 cm）和云杉種子。將土壤風(fēng)干后過(guò)5 mm 篩，進(jìn)行高壓滅菌后待用。同時(shí)，我們在云杉天然林中采集子實(shí)體8 種（圖2），這些子實(shí)體在天然林中較為豐富，人工林中較為貧乏，每種采集10株至更多（經(jīng)前期調查，與人工林相比，在天然林中出現頻率和豐度都比較高的種類(lèi)）。用毛刷將子實(shí)體附著(zhù)的土壤顆粒及雜質(zhì)去除，然后在40 ℃的烘箱烘至48 h，室溫保存。將烘干菌株磨碎，用無(wú)菌水稀釋至孢子濃度為1×106孢子/mL（利用血細胞計數器測量）時(shí)待用，具體操作參考文獻[30]。

1.2 室內育苗及真菌接種

將采集的云杉種子，用30 % H2O2消毒30 min后用無(wú)菌水沖洗，將消毒并沖洗后的種子播種到含有1%葡萄糖的水瓊脂培養皿上，在溫度20 ℃以及連續熒光燈下萌發(fā)兩周，直到主根長(cháng)至10 mm 長(cháng)。將云杉小幼苗移栽到含有泥炭土、珍珠巖和蛭石（2∶1∶1）的無(wú)菌植物組織培養瓶里，放置在2 m（長(cháng)）×1 m（寬）×0.3 m（深）種子托盤(pán)中，在22 ℃恒溫（日光：黑暗=16 h：8 h）人工氣候箱中培養，每隔兩周補充一次營(yíng)養液，4 個(gè)月后選擇長(cháng)勢一致的幼苗進(jìn)行接種實(shí)驗，接種前操作均需處于無(wú)菌環(huán)境中。將采集的亞高山針葉林云杉人工林自然生長(cháng)環(huán)境的0～15 cm 表層土作為基質(zhì)，風(fēng)干后過(guò)2 mm 篩，進(jìn)行兩輪高壓滅菌（121 ℃，20 min）。將土壤分裝到46個(gè)花盆里，隨后將上述長(cháng)勢一致的幼苗移栽到花盆中，每個(gè)花盆栽種一株云杉幼苗，放置在帶空調氣候室中培養，氣候室恒定溫度為20 ℃，全光譜生長(cháng)燈從早晨7：30 亮至傍晚18：30，設有室內加濕器使室內濕度保持在60%。并每隔4 d給幼苗噴灑等量的水，46個(gè)花盆分為5種不同梯度的外生菌根真菌多樣性接種處理，除空白對照14 個(gè)重復，其他接種處理皆是8 個(gè)重復（CK.無(wú)接種組；
S1.1 種真菌接種組；
S2.2種真菌接種組；
S4.4種真菌接種組；
S8.8種真菌接種組）。處理時(shí)用注射器將制備好的外生菌根真菌孢子液體噴灑至土壤表面，每種處理的外生菌根真菌組合見(jiàn)表1。如表1 所示，每種外生菌根真菌體積為25 mL（濃度為1×106孢子/mL），為了保持處理組之間的一致性，剩余體積用滅菌(無(wú)活性)的外生真菌孢子液進(jìn)行補充（4 種接種處理補充100 mL；
兩種接種處理補充150 mL；
一種接種處理補充175 mL；
對照補充200 mL），具體方法參考文獻[31]。

表1 外生菌根真菌種類(lèi)及接種處理方式Table 1 Species and inoculation methods of ectomycorrhizal fungi mL

1.3 外生菌根真菌侵染判斷及種類(lèi)鑒定

從2019 年9 月接種后開(kāi)始培養，直到2020 年7月按照實(shí)驗處理分組收集培養后的云杉幼苗以及土壤（對照組14盆，其余處理組各8盆）。利用體式顯微鏡觀(guān)察外生菌根真菌對云杉幼苗根系是否侵染成功。在顯微鏡下觀(guān)察發(fā)現，S4和S8實(shí)驗組各有2株幼苗未被外生菌根真菌侵染。剩余的S4均被侵染3～4 種外生菌根真菌，S8均被侵染5～8 種外生菌根真菌。S2實(shí)驗組有1株幼苗未成功侵染。在S1實(shí)驗組中，有2 株未成功定殖。CK 對照組中有1 株幼苗被Russula virescens侵染，因此與S1合并進(jìn)行后續計算。CK 中有3 株幼苗被真菌污染，但無(wú)法用分子方法鑒定。因此，將它們從分析中刪除。最后，CK 組有10 個(gè)花盆作為重復，S1、S2有7 個(gè)花盆作為重復，S4、S8試驗組有6個(gè)花盆作為重復。侵染成功的外生菌根在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)分類(lèi)，并將每種外生菌根真菌所侵染的根尖在體式顯微鏡下計數，菌根侵染率（%）=（形成菌根根段數/被檢根段總數）×100[32]。各處理間的外生菌根真菌侵染率見(jiàn)附圖3。隨后根據DNeasy plant mini kit（Qiagen）試劑盒的說(shuō)明步驟對每種外生菌根真菌所侵染云杉根尖進(jìn)行DNA 提取，再利用真菌特定引物ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）進(jìn)行擴增并測序，最終得到的序列通過(guò)NBCI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Unite fungi（https://unite.ut.ee/）真菌鑒定網(wǎng)站進(jìn)行比對，確認外生菌根真菌種類(lèi)如下表，外生菌根真菌信息皆參考相關(guān)文獻[33-40]。測序序列已儲存在NBCI基因庫中（登錄號OL475404-OL475411）。

1.4 土壤物理生化性質(zhì)測定

我們利用抖落法取云杉幼苗根際土壤[41]，土壤過(guò)2 mm篩后，分為兩部分，一部分鮮土用于測定土壤水分、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、微生物生物量碳氮、可溶性全氮和可溶性有機碳。剩余風(fēng)干部分用于測定土壤pH、有機碳、全氮和全磷含量。利用電位法對土壤pH進(jìn)行測定[42](水土比為2.5∶1)；
利用烘干法對土壤水分進(jìn)行測定[43]；
風(fēng)干土壤過(guò)100目（0.149 mm）篩后，取0.01 g，利用重鉻酸鉀容量法-外加熱法對土壤總有機碳含量進(jìn)行測定[44]；
取0.20 g（0.149 mm）風(fēng)干土利用半微量凱氏定氮法對土壤全氮含量進(jìn)行測定[45]；
取0.20 g（0.149 mm）風(fēng)干土經(jīng)過(guò)高氯酸-濃硫酸分解后，利用鉬銻抗-比色法[46]（波長(cháng)：700 nm）對土壤全磷含量進(jìn)行測定；
微生物生物量碳和氮的測定采用氯仿熏蒸浸提法[47]，熏蒸組用去乙醇氯仿熏蒸24 h，然后用0.5 mol/L K2SO4溶液浸提。對照組（未熏蒸），提取過(guò)程同熏蒸組。浸提液中的總有機碳和全氮采用全自動(dòng)碳氮分析儀（Multi N/C 2100,Analytik Jena, Germany）測定。微生物生物量碳的轉換系數采用0.45[48]，微生物生物量氮的轉換系數采用0.54[49]?？扇苄杂袡C碳和可溶性全氮含量使用對照組提取的總有機碳、全氮含量；
取10 g 鮮土用50 mL 2 mol/L 氯化鉀提取，硝態(tài)氮含量用紫外分光光度校正因數法測定[50（]波長(cháng)：220 和275 nm;UV spectrophotometry（UV-1601, Shimadzu Inc.）），而銨態(tài)氮含量則用靛酚藍-比色法進(jìn)行測定[51（]波長(cháng)：625 nm）。

1.5 數據處理

單因素方差分析前對數據進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性檢驗，部分數據通過(guò)數據轉換，當滿(mǎn)足正態(tài)分布及方差齊性時(shí)，利用SPSS（statistical product and service solutions）軟件對其進(jìn)行單因素方差分析，使用LSD 方法進(jìn)行事后兩兩比較，當滿(mǎn)足正態(tài)分布及方差不齊時(shí)，使用塔姆黑尼方法進(jìn)行事后兩兩比較。其余不符合正態(tài)分布數據兩兩比較利用非參數檢驗不同處理之間土壤理化指標的差異性，最后用Pearson 相關(guān)性分析檢測各指標之間的相關(guān)關(guān)系，并結合Microsoft Excel 及Origin進(jìn)行數據整理及繪圖。

2.1 外生菌根真菌多樣性對土壤理化性質(zhì)的影響

圖1a 表明，土壤含水率在CK 及各處理之間無(wú)顯著(zhù)差異，都保持在30%～35%之間。圖1b 所示測得土壤pH 均呈弱酸性，其中S4的pH 值（5.44）要顯著(zhù)高于CK及其他處理（5.21～5.30）（P＜0.05）。

圖 1 外生菌根真菌多樣性對土壤酸堿度和土壤含水率的影響Figure 1 Effect of ectomycorrhizal diversity on soil pH and soil moisture content

如圖2a、圖2b所示，CK對照組有機質(zhì)（37.62 g/kg）和有機碳（21.82 g/kg）含量顯著(zhù)高于S8處理組（有機質(zhì)22.81 g/kg；
有機碳13.23 g/kg）（P＜0.05），總體隨ECM真菌接種多樣性的增高呈下降趨勢。據圖2c所示，可溶性有機碳含量各處理之間無(wú)顯著(zhù)差異，但在趨勢上呈現出ECM 真菌接種增加了可溶性有機碳含量，并隨接種ECM真菌多樣性的增加有所降低。

圖2 外生菌根真菌多樣性對有機質(zhì)含量、有機碳含量和可溶性有機碳含量的影響Figure 2 Effect of ectomycorrhizal fungal diversity on organic matter content, organic carbon content, and dissolved organic carbon content

如圖3a所示，總體趨勢上，隨ECM 真菌接種多樣性的增高土壤硝態(tài)氮含量呈上升趨勢，除S4（29.68 mg/kg）土壤硝態(tài)氮含量顯著(zhù)低于CK 及其他處理（P＜0.05）之外，S2（53.15 mg/kg）和S8（64.56 mg/kg）土壤硝態(tài)氮含量顯著(zhù)高于CK（44.81 mg/kg）和S1（48.30 mg/kg）處理（P＜0.05）。圖3b 顯示，S2（30.89 mg/kg）土壤銨態(tài)氮含量顯著(zhù)高于其他處理（P＜0.05）。圖3c 顯示，土壤無(wú)機氮含量與土壤硝態(tài)氮含量的趨勢相似，隨ECM真菌接種多樣性的增高呈上升趨勢（S4除外），S8（87.23 mg/kg）（P＜0.05）的無(wú)機氮含量顯著(zhù)高于S4（49.65 mg/kg）和CK（68.45 mg/kg）；
S4（49.65 mg/kg）的無(wú)機氮含量顯著(zhù)低于其他處理（P＜0.05）（圖3c）。除此之外，我們發(fā)現S2（483.72 mg/kg）和S8（424.12 mg/kg）的可溶性全氮含量要顯著(zhù)高于S4（181.18 mg/kg）（P＜0.05）（圖3d）。而土壤全氮和全磷含量在各處理組之間無(wú)顯著(zhù)差異（圖3e和圖3f）。

圖3 外生菌根真菌多樣性對土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、無(wú)機氮、可溶性全氮、全氮和全磷含量的影響Figure 3 Effect of ectomycorrhizal fungal diversity on nitrate nitrogen, ammonium nitrogen, inorganic nitrogen, total dissolved nitrogen, total nitrogen, and total phosphorus content

2.2 外生菌根真菌多樣性對土壤生物性質(zhì)的影響

圖4a 所示，S4（620.1 mg/kg）土壤微生物生物量碳含量顯著(zhù)低于S2（1 140.45 mg/kg）（P＜0.05），而與其他處理之間無(wú)顯著(zhù)差異。雖然土壤微生物生物量氮含量、微生物生物量碳氮比（微生物生物量C∶N）在各處理之間無(wú)顯著(zhù)差異，但S4的微生物生物量碳、氮（154.7 mg/kg）含量均最低，而微生物生物量C∶N卻最高（6.31）（圖4b、圖4c）。

圖4 外生菌根真菌多樣性對土壤微生物生物量碳、微生物生物量氮和微生物生物量C∶N的影響Figure 4 Effect of ectomycorrhizal fungal diversity on microbial biomass carbon, microbial biomass nitrogen, and microbial biomass

2.3 土壤物理化學(xué)生物指標的雙變量Pearson 相關(guān)關(guān)系分析

如表2 所示，土壤pH 與土壤含水率、微生物生物量C∶N 呈顯著(zhù)正相關(guān)關(guān)系，而與微生物生物量氮、土壤硝態(tài)氮及可溶性全氮含量呈顯著(zhù)負相關(guān)關(guān)系。此外，土壤微生物生物量氮還分別與微生物生物量碳、硝態(tài)氮及可溶性全氮具顯著(zhù)正相關(guān)關(guān)系。微生物生物量C∶N則與硝態(tài)氮呈顯著(zhù)負相關(guān)關(guān)系?？扇苄杂袡C碳與可溶性全氮呈中度正相關(guān)關(guān)系。土壤可溶性全氮與硝態(tài)氮呈中度正相關(guān)關(guān)系。土壤有機質(zhì)與土壤有機碳呈高度正相關(guān)關(guān)系（|r|≥0.8，高度相關(guān)；
0.5≤|r|＜0.8，中度相關(guān)；
0.3≤|r|＜0.5，低度相關(guān)）。

3.1 外生菌根真菌多樣性對根際土壤理化性質(zhì)的影響

本實(shí)驗人工控制培養室濕度，所以土壤含水率在各處理之間無(wú)顯著(zhù)差異。而圖1b所示，S4接種處理的土壤pH卻顯著(zhù)高于CK及其他接種處理，且由表2可知，可溶性全氮（P＜0.01 ,R=-0.56**）、硝態(tài)氮（P＜0.01,R=-0.75**）與pH 皆呈負相關(guān)。結合分析得出如下可能的解釋?zhuān)孩佥^S4處理而言，其他ECM真菌接種處理下的物種間特殊作用使云杉根系及根際微生物分泌更多的有機酸[52]，致使其他處理pH顯著(zhù)降低。②其次，在S4接種處理下，RV、LB、HL和RL 物種間作用，促進(jìn)植物對養分的吸收（如等），植物在吸收同時(shí)為了保持電荷平衡，需釋放OH-進(jìn)而導致pH 值升高，這除了能解釋pH變化外，還解釋了其與可溶性全氮、硝態(tài)氮呈負相關(guān)的原因。我們的研究結果與R. Pena 的研究相一致[53]。

由圖3 中土壤氮磷養分含量結果可知，川西亞高山人工云杉林土壤較為貧瘠[54]。與較養分肥沃環(huán)境相比，在貧瘠土壤環(huán)境中ECM真菌更能與宿主產(chǎn)生養分競爭關(guān)系，且更能與宿主達成功能互補關(guān)系去影響土壤養分[10,53]。當接種單種ECM 真菌時(shí)，對土壤有機質(zhì)分解的影響程度取決于真菌種類(lèi)[10]。如圖2 所示，與CK 相比，S1土壤有機質(zhì)和有機碳含量較低（無(wú)顯著(zhù)差異），而可溶性有機碳含量卻有增高趨勢，也許能說(shuō)明RV 真菌能增強對土壤有機質(zhì)的分解。當8 種ECM 真菌接種于宿主植物時(shí)顯著(zhù)降低了土壤有機質(zhì)、有機碳含量，而可溶性有機碳含量卻有增高趨勢。這說(shuō)明了SG、CR、IG 和TF 4 種ECM真菌的加入補充了S1、S2和S4中ECM真菌組合在碳轉化方面的功能缺陷[55]。我們的關(guān)于碳轉化相關(guān)酶的研究結果顯示菌根真菌多樣性顯著(zhù)影響了有關(guān)碳轉化的酶活性（附表3），證明了ECM 多樣性越高，對土壤有機質(zhì)分解作用越強[4]。這與S. M.Velmala等[4]的研究結果一致，隨挪威云杉接種ECM真菌多樣性的增加，分泌如半纖維素酶、水解酶、漆酶和幾丁質(zhì)酶等胞外酶種類(lèi)增加，ECM共生體為獲取更多氮磷養分而對有機質(zhì)的分解作用增強。而可溶性有機碳含量未隨ECM 多樣性的增加呈明顯的遞減趨勢，可能是由于不同ECM 真菌組合接種，對土壤微生物生物量及群落結構的影響不同[56]，導致其對土壤有機碳的利用產(chǎn)生不同程度的影響[57]。我們的解釋得到如下研究的證實(shí)。有研究[58]指出不同ECM 真菌分類(lèi)群分泌含碳化合物的類(lèi)型和能力也各不相同，從而不同種類(lèi)真菌組合會(huì )對根際土壤微生物群落組成產(chǎn)生不同的影響。

表2 土壤物理化學(xué)生物指標的雙變量Pearson相關(guān)關(guān)系分析表Table 2 Bivariate Pearson correlation analysis table of soil physical, chemical, and biological indexes

由于ECM 真菌占據的生態(tài)位不同而導致其功能具有多樣性[5]，這也是我們探討ECM 真菌多樣性影響有機質(zhì)分解、養分利用的重要因素。ECM真菌對于活化土壤氮磷養分的作用有兩個(gè)方面，一方面是其能通過(guò)直接分泌酶活化土壤穩定養分，從而活化其中氮磷養分。另一方面，ECM宿主植物可通過(guò)維持一個(gè)相對封閉的營(yíng)養循環(huán)，招募具有氮分解和礦化功能的微生物，從而間接活化氮磷養分[54,59-60]。在森林生態(tài)系統中，部分早期富集的氮，可能來(lái)源于凋落物所釋放的溶質(zhì)，這部分早期富集的氮不受大多數ECM真菌種類(lèi)的影響[53]，由于ECM真菌的這種趨于活化有機質(zhì)氮養分的特性，使氮養分更易被宿主吸收利用[61]。圖3c、圖3d中可溶性全氮含量和無(wú)機氮含量變化趨勢相同，都隨著(zhù)ECM真菌多樣性的增加而增加（4種ECM 真菌接種處理除外），此研究結果說(shuō)明接種多樣性較高的菌根真菌群落能夠提高土壤有效氮含量。這也與C. Truong等[7]的研究結果相吻合。其表明ECM 真菌物種豐富度與亮氨酸酶活性顯著(zhù)相關(guān)，表明較高多樣性的ECM真菌群落在強氮限制的環(huán)境中有助于增加氮可利用性，且我們的研究結果也發(fā)現菌根真菌多樣性顯著(zhù)提高了與氮轉化相關(guān)的根系酶活性（N-acetyl-β-Dglucosaminidase 和Leucine aminopeptidase）（附表3）。此外我們的研究結果顯示，S4可溶性全氮含量顯著(zhù)低于S2和S8，硝態(tài)氮含量更是顯著(zhù)低于CK，其原因可能是S4真菌組合并不利于有機質(zhì)分解并活化其中固定的氮元素，但卻有利于宿主吸收硝態(tài)氮[53,62]。如在R. Pena 等[53]關(guān)于山毛櫸（Fagus sylvaticaL.）幼苗栽培試驗中，發(fā)現ECM真菌組合的功能多樣性具應力激活效應，即環(huán)境限制條件下，ECM 組合比非菌根更有利于對無(wú)機氮的吸收。土壤全氮含量在各處理組之間無(wú)顯著(zhù)差異，其原因可能是土壤中超過(guò)90%的氮以有機形式存在，即便ECM真菌活化其中的一小部分，也會(huì )對碳氮循環(huán)產(chǎn)生重大影響[55]，而失去的這部分對于全氮而言微不足道，并不至于使各組之間產(chǎn)生顯著(zhù)差異。而全磷作為土壤養分的限制因子，含量極低，并與全氮一樣大部分被固定且難以被利用，在C. Plassard 等[52]的研究中發(fā)現ECM 真菌會(huì )產(chǎn)生低分子量的有機陰離子可能對礦物結合磷的釋放起決定性作用。但在本試驗中，不同多樣性梯度的外生菌根真菌群落接種對土壤全磷含量無(wú)顯著(zhù)影響，這可能是因為土壤磷含量較低的環(huán)境中，較簡(jiǎn)單的ECM真菌群落產(chǎn)生的根外菌絲有限，使全磷活化為有效磷的能力受到限制，因此對土壤全磷含量沒(méi)有顯著(zhù)影響。

3.2 不同梯度ECM接種對根際微生物性質(zhì)的影響

ECM真菌在服務(wù)宿主植物時(shí)可產(chǎn)生化感作用，能間接改變根際土壤微生物群落特征，這種作用稱(chēng)之為“菌根根際作用[56]”。當ECM 真菌接種時(shí)可能對其根際微生物群落會(huì )產(chǎn)生抑制[47]或促進(jìn)作用[56]?！熬H作用”為我們理解此試驗各處理間微生物生物量的差異提供了一種解釋[63]。土壤微生物生物量C∶N 可以在一定程度上反映土壤微生物種類(lèi)和區系[64]，微生物生物量C∶N 一般是5～6[65]，而細菌生物量C∶N要低于真菌[64,66]，生物量C∶N越高，真菌所占比例越高。依據微生物生物量C∶N 的實(shí)驗結果，我們可以猜測不同梯度多樣性的ECM真菌群落接種影響了根際土壤中真菌與細菌的比例，如圖4所示，雖然S4微生物生物量碳、微生物生物量氮及微生物生物量C∶N 與CK 無(wú)顯著(zhù)差異，但S4的微生物生物量碳和微生物生物量氮含量在趨勢上卻低于CK，S4的微生物生物量C∶N在趨勢上高于CK，這也許是因為S4處理組的ECM 真菌對于土壤細菌具有抑制作用[63]。另一方面，可能由于S4中的ECM真菌在接受宿主植物高碳分配的條件下，與其他土壤微生物在吸收養分的競爭中處于優(yōu)勢[67]。而S1、S2可能是因為簡(jiǎn)單的ECM 真菌組成對其他包括細菌在內的微生物不構成養分競爭威脅。S8則更大程度上是因為ECM真菌的內部之間的競爭[11]，導致真菌優(yōu)勢相較S4有所減弱。我們的研究結果也進(jìn)一步表明微生物生物量氮、微生物生物量C∶N 與pH 分別呈顯著(zhù)負相關(guān)（P＜0.01，R=-0.45**）和顯著(zhù)正相關(guān)（P＜0.01，R= 0.45**）關(guān)系，與硝態(tài)氮含量分別呈顯著(zhù)正相關(guān)（P＜0.01，R= 0.52**）和顯著(zhù)負相關(guān)（P＜0.01，R=-0.45**）關(guān)系，微生物生物量氮與土壤可溶性全氮呈顯著(zhù)正相關(guān)（P＜0.05，R=0.35*）關(guān)系。這些結果說(shuō)明了由菌根真菌多樣性變化導致的可利用性氮和pH的變化可能會(huì )間接地對根際微生物群落產(chǎn)生影響[56,63]。在R. H. Jongbloed 等[68]的研究中發(fā)現銨態(tài)氮的積累使營(yíng)養基酸化增強，促進(jìn)了嗜酸真菌繁殖生長(cháng)，進(jìn)而改變了微生物群落。

4 種ECM 真菌接種組合組可能與其他接種組合的分解吸收能力、分泌作用不同，從而影響土壤中酸性可溶性有機物質(zhì)及礦質(zhì)離子含量，最終導致pH值升高。由于其各真菌種類(lèi)間功能互補性，較高多樣性ECM真菌群落接種可促進(jìn)土壤有機質(zhì)分解，增加土壤可利用性氮，但是4種ECM真菌組合接種可能有利于宿主植物對氮的吸收，但不利于從有機質(zhì)中活化氮組分。而在全氮、全磷含量極低的土壤中，較簡(jiǎn)單的ECM真菌群落并不會(huì )對全氮和全磷產(chǎn)生大的影響。ECM真菌多樣性的不同，可能會(huì )通過(guò)真菌物種相互之間的促進(jìn)或抑制作用使根際土壤微生物群落結構發(fā)生改變，特別是HL、RL、IG 和TF4 種ECM 真菌的接種對土壤微生物生物量C∶N影響較為明顯。上述結果總體說(shuō)明，與宿主共生的外生菌根真菌群落的多樣性越高，其對土壤有機質(zhì)分解以及提高土壤氮的可利用性有積極的作用。

我們本次試驗的可在一定程度上為認識ECM真菌多樣性在改良土壤理化生物性質(zhì)的作用上提供科學(xué)依據。但對于幼苗的生長(cháng)影響卻很難等同于對成年樹(shù)木的生長(cháng)影響[4,53]。而且幼苗的試驗栽培均處于人工設置的適宜生長(cháng)的環(huán)境中，不同于野外存在的各種逆境條件，栽培土壤上也相較野外缺少了凋落物的覆蓋，這些都啟示我們在試驗研究中要開(kāi)拓的方向，要由室內轉移到野外，讓ECM 真菌多樣性作用的研究能真正行使其在自然生態(tài)系統中。目前國內對ECM真菌多樣性的研究相對較少，且室內接種的ECM 真菌種類(lèi)較少，為對ECM 真菌多樣性對云杉根際土壤物理生化性質(zhì)的影響機制進(jìn)行全面了解，之后的研究可定位于樹(shù)種多樣性或不同海拔的ECM 真菌多樣性梯度設置，揭示ECM真菌多樣性對土壤碳氮循環(huán)的潛在影響機制，以期進(jìn)一步深入理解川西亞高山地下生態(tài)過(guò)程，并為區域退化森林生態(tài)系統恢復重建提供新的認識。