吳宣嵐 饒舜 吳勝軍
浙江大學(xué)醫學(xué)院附屬邵逸夫醫院錢(qián)塘院區檢驗科，杭州 310018
血紅蛋白（Hb）變異體是由位于Hb 的α-、β-、γ-、δ-珠蛋白鏈上的點(diǎn)突變而引起的Hb 氨基酸序列的改變，其攜帶者大多不表現出生理功能的改變，但當人體患有復合α 或β 型地中海貧血時(shí)，會(huì )加重其臨床癥狀，表現為中到重度貧血[1]。由于突變、遷徙、融合與隔離等因素的影響，Hb 變異體存在地域差異，我國長(cháng)江以南地區變異體攜帶率明顯高于長(cháng)江以北地區[2-3]。因此對高發(fā)地區進(jìn)行篩查，特別是對我國南方地區Hb 變異體的流行病學(xué)研究對于地中海貧血的早期發(fā)現和治療具有重要意義。關(guān)于杭州地區Hb 變異體的流行情況，至今鮮有報道。
糖化Hb（HbA1c）是人體血液中葡萄糖與Hb β鏈N 末端纈氨酸殘基以共價(jià)鍵結合形成的穩定化合物，可反映糖尿病患者過(guò)去2～3 個(gè)月的平均血糖水平[4]。目前臨床上常用的HbA1c 檢測技術(shù)有離子交換高效液相色譜法和毛細管電泳法[5]。前期有研究發(fā)現Hb 變異體HbS、HbC、HbE 對離子交換高效液相色譜法HbA1c 檢測系統會(huì )產(chǎn)生一定干擾[6]，本研究擬通過(guò)Hb 電泳技術(shù)和基因測序技術(shù)，分析本地區主要Hb 變異體流行型別，通過(guò)比較分析兩種HbA1c 檢測系統對Hb 變異體的檢測結果，判斷檢測效能，現報道如下。
收集2021年1—8月浙江大學(xué)醫學(xué)院附屬邵逸夫醫院錢(qián)塘院區住院、門(mén)診患者以及健康體檢者血液樣本5 068 份，分別檢測并記錄受試者Hb、平均紅細胞體積（MCV）、平均血紅蛋白濃度（MCH）、空腹血糖(FPG)和毛細管電泳法HbA1c 結果，并對儀器提示的變異體樣本進(jìn)行Hb 電泳和基因測序確認變異體類(lèi)型。離子交換高效液相色譜法對變異體樣本進(jìn)行HbA1c 重新檢測。本研究經(jīng)邵逸夫醫院倫理委員會(huì )審批通過(guò) （倫理審批號：
倫審2022 研第0064 號）。
血常規檢測采用邁瑞BC-6800 全自動(dòng)血細胞分析儀及配套試劑，血糖檢測采用貝克曼AU5831全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑，HbA1c 檢測采用毛細管電泳法Sebia Capillary 3 TERA 和離子交換高效液相色譜法TOSOH HLC-723G8 全自動(dòng)HbA1c分析儀及配套試劑。所有檢測嚴格按試劑盒和儀器說(shuō)明書(shū)執行。
抽取受試者靜脈血，實(shí)驗室同時(shí)檢測其血常規、FPG 和HbA1c。血細胞分類(lèi)、計數采用鞘流阻抗法、激光散射法、接合熒光染色的流式細胞技術(shù)，Hb測定采用比色法，血糖監測采用己糖激酶法，以毛細管電泳法檢測系統Sebia Capillary 3 作為參比方法。Hb 電泳采用Sebia Capillary 3 OCTA 血紅蛋白電泳儀，Hb 測序采用Applied Biosystems 3730XL 測序儀。HbA1c 正常值范圍為4.0%～6.0%。
采用SPSS22.0 統計軟件對兩種儀器HbA1c 檢測結果進(jìn)行分析處理，以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學(xué)意義。
5 068 份血液樣本中，共檢出Hb 變異體20 份，占總數的0.39%，變異體包括10 份HbG-Taipei，3份HbG-Honolulu，2 份HbE，2 份 HbQ-Thailand，1 份HbG-Coushatta，1 份HbUbe-2 和1 份HbNew York。
將20 例HbA1c 異常者編號1～20，表1顯示，以Sebia Capillary 3（毛細管電泳法）作為參比儀器，TOSOH HLC-723G8 （離子交換高效液相色譜法）和Sebia Capillary 3 TERA（毛細管電泳法）檢測，結果除HbNew York 外，其他均表現為負偏倚。10 份HbG-Taipei 變異體樣本中，離子交換高效液相色譜法檢測HbA1c 偏倚率均>20%，且該方法將5 份HbA1c 異常樣本誤判為正常（編號分別為3、4、9、15和17）。離子交換高效液相色譜法與毛細管電泳法的HbA1c 檢測結果分別為（4.66±0.86）%和（6.19±0.88）%，差異有統計學(xué)意義（t=-9.37，P<0.001）。
表1 Hb 變異體樣本來(lái)源患者空腹血糖及其HbA1c 檢測結果（n=20）
經(jīng)基因測序結果顯示，20 份變異體樣本均與Hb 電泳分析型別結果一致，測序突變位點(diǎn)及其突變氨基酸詳見(jiàn)表2。
表2 Hb 變異體基因突變信息（n=20）
圖1為α 鏈Hb 變異體電泳圖，包含HbGHonolulu、HbUbe-2 和HbQ-Thailand 等類(lèi)型，圖2為β 鏈Hb 變異體電泳圖，包含HbG-Taipei、HbG-Coushatta、HbE 和HbNew York 等類(lèi)型。
圖1 杭州地區α 鏈Hb 變異體電泳圖
圖2 杭州地區β 鏈Hb 變異體電泳圖
了解Hb 變異體的攜帶情況，并采用精準的方法進(jìn)行不同變異體的檢測，有助于地中海貧血的早發(fā)現和早治療。2001年全國大規模分子流行病學(xué)調查研究發(fā)現Hb 變異體基因攜帶率為0.33%，其中長(cháng)江以南地區為0.367%[2]，高于全國水平，因此對杭州地區Hb 變異體的流行情況進(jìn)行檢測，對疾病防控有著(zhù)重要意義。
本研究發(fā)現杭州地區變異體攜帶率為0.4%，略高于長(cháng)江以南地區報道[2]。全球已經(jīng)發(fā)現的Hb 變異體有1 000 余種，其中最常見(jiàn)的為HbS、HbC、HbE及HbD[7]。本研究對杭州地區發(fā)現的20 份變異體血樣本進(jìn)行測序發(fā)現，主要的Hb 變異體為HbGTaipei，占總變異體的50%。HbG-Taipei（β22 谷氨酸→甘氨酸）是Blackwell 等[8]于1969年在我國臺灣地區漢族人中首次發(fā)現的，之后在我國多個(gè)省份的漢族及少數民族中均有發(fā)現。目前認為HbGTaipei 為中國特有的一種Hb 變異體[9]。HbG-Taipei和Hb A 具有相同的氧親和力，變異后只引起分子表面電荷的變化，而不會(huì )影響Hb 結構的穩定性或引起高級構象的改變，患者臨床癥狀往往不明顯。文中的10 例HbG-Taipei 攜帶者，均未表現出血液系統相關(guān)疾病。目前HbG-Taipei 雖在國內外華人中多有報道[10-11]，但如此高比例HbG-Taipei 的出現，值得本地區深入探究其流行和播散趨勢。
近期研究發(fā)現HbS、HbC、HbE 和HbG 等變異體對HbA1c 會(huì )產(chǎn)生一定干擾，離子交換高效液相色譜法受干擾最為明顯[12]。分析其原因，主要是離子交換高效液相色譜法雖對HbA1c 具有很強的分辨能力，但其未能將Hb 變異體和HbA0、HbA1c 完全分離，造成HbA1c 檢測結果受干擾。隨著(zhù)糖尿病發(fā)病率的逐年升高以及Hb 變異體分布區域的逐漸擴大，常見(jiàn)Hb 變異體對HbA1c 影響的結果解讀變得越來(lái)越重要。HbG-Taipei 變異體對HbAlc 檢測系統的影響，國內外少有報道，2012年曾有1 例HbGTaipei 攜帶者FPG 為9.6 mmol/L,離子交換高效液相色譜法檢測HbA1c 結果正常的報道[13]。本研究發(fā)現的10 份HbG-Taipei 變異體樣本中，離子交換高效液相色譜法檢測HbA1c 偏倚率均>20%，且該方法將5 例HbA1c 異常者誤判為正常。離子交換高效液相色譜法HbA1c 檢測系統目前臨床實(shí)驗室中應用廣泛[12]，因此今后使用過(guò)程中應隨時(shí)關(guān)注Hb 變異體的影響。
毛細管電泳法檢測HbA1c 技術(shù)2012年首次推出[14]，其能準確將正常和異常Hb 區分開(kāi)來(lái)，從陰極到陽(yáng)極依次為HbA2、HbE、HbS、HbD、HbF、HbA0、其他HbA、HbG、HbA1c 和HbH 等，因此能反映異常Hb 攜帶者的真實(shí)HbA1c 水平，目前國內關(guān)于該新技術(shù)的臨床應用較少[15]。本研究發(fā)現該方法不僅能準確檢測HbA1c 水平，還能對變異體進(jìn)行Hb 電泳分析。
綜上所述，HbG-Taipei 為杭州地區最為流行的Hb 變異體。相比離子交換高效液相色譜法，毛細管電泳法檢測系統在HbG-Taipei 變異體樣本HbA1c檢測中更能準確反映受試者真實(shí)血糖水平。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突
作者貢獻聲明吳宣嵐：數據分析、設計實(shí)驗和文章撰寫(xiě)；
饒舜：數據收集、統計分析；
吳勝軍：對文章的知識性?xún)热葑髋u性審閱、指導和經(jīng)費支持
