刺山柑種子休眠及萌發(fā)特性研究

王云興, 吾買(mǎi)爾夏提·塔漢

(新疆農業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 烏魯木齊 830000)

刺山柑(CapparisspinosaL.)為山柑科山柑屬多年生藤本蔓生落葉小半灌木,又稱(chēng)野西瓜、抗旱草等[1]。廣泛分布于西班牙、意大利、土耳其和伊朗等國,我國新疆、西藏和甘肅也有分布,常見(jiàn)于石質(zhì)低山、礫石荒漠、鹽堿地和戈壁灘等[1-2]。刺山柑葉、果、根皮均可入藥,有祛風(fēng)除濕、止痛、消腫等功效,可治療關(guān)節炎、風(fēng)濕病等;其花蕾作為一種調味品深受歐洲人喜愛(ài)[3-4]。刺山柑是一種多用途植物,具有耐旱、耐高溫、耐貧瘠和耐鹽堿等多種優(yōu)良特性,是荒漠生態(tài)恢復與植被重建的優(yōu)選物種[2]。近年來(lái),刺山柑作為固沙植物具有極高的觀(guān)賞價(jià)值,廣泛栽培于旱生植物園[2,5]。

刺山柑可通過(guò)種子繁殖或莖段扦插繁殖,然而,刺山柑在自然條件下存在萌發(fā)率低與生根困難等問(wèn)題,使其在許多地區繁殖栽培困難,限制了該作物的推廣[3,6-15]。過(guò)度放牧和過(guò)度收割導致刺山柑資源極度匱乏,甚至還產(chǎn)生了極其嚴重的荒漠生態(tài)危機[16-17]。刺山柑種子萌發(fā)率低,可能存在休眠,但不同的學(xué)者持有不同的觀(guān)點(diǎn)[18]。研究表明,可能導致刺山柑種子低萌發(fā)的休眠類(lèi)型分別為物理休眠、生理休眠和組合休眠[3,5,11-12,14,16-17,19]。本研究根據Baskin[20]提出的休眠分類(lèi)系統,在一定的光照和溫度條件下通過(guò)低溫層積、GA浸泡、干藏和埋藏等方法,探討刺山柑種子的休眠類(lèi)型和種子萌發(fā)特性。

1.1 材 料

供試材料為刺山柑的成熟種子,2021 年 9 月分兩批采集于新疆哈密二堡鎮(93°01′47″E,42°58′19″N)戈壁灘的自然群落,種子在清水中浸泡從果肉中分離出來(lái),室溫陰干后保存于干燥通風(fēng)處備用。

1.2 方 法

1.2.1種子的形態(tài)指標和千粒重測定

在體式顯微鏡下觀(guān)測種子的顏色、形狀及大小,重復20次。隨機選取成熟、發(fā)育正常的果實(shí),用游標卡尺分別測量20粒種子的長(cháng)度。采用四分法取一定量種子(大于4 000粒),將種子分為4份,每份隨機數1 000粒稱(chēng)重,4次結果加權平均,即得種子千粒重。

1.2.2吸水試驗

為了確定刺山柑種子的吸水情況,2022年3月31日,在實(shí)驗室將刺山柑種子分別放入5個(gè)墊有雙層濕濾紙的培養皿中,每皿50粒。先用Sartorius BS 124 S型(0.000 1 g)電子天平稱(chēng)量刺山柑種子的原始重量,從未吸水(干種子)起,每隔30 min取出(隨種子的吸水速率而適當調整稱(chēng)重時(shí)間),用濾紙吸干種子表面的水分后,在電子天平上稱(chēng)重,直到種子質(zhì)量不再增加為止,繪制吸水曲線(xiàn),分析種子的吸水動(dòng)態(tài)變化。

吸水率/%=[(濕重-干重)/干重]×100%。

1.2.3萌發(fā)特性研究

將種子置于1%的次氯酸鈉溶液中消毒10 min,然后用自來(lái)水沖洗3遍,蒸餾水沖洗1遍,每處理均為25粒種子,4次重復,共100粒。種子均勻擺放于墊有2層濾紙,直徑為90 mm的培養皿中,持續培養28 d。實(shí)驗的光照條件設置為每天12 h光照[100 μmol/(m2·s),400～700 nm,白熾燈光]和全黑暗,黑暗處理是將培養皿包裹于錫紙中。

胚根突破種皮視為萌發(fā)。在光照條件下培養的種子每24 h統計一次萌發(fā)數,并將萌發(fā)的種子取出,每天加適量蒸餾水以保持濕度一致;全黑暗處理的種子要保持完全避光,萌發(fā)率在綠光燈下每7 d檢測一次。實(shí)驗結束后未萌發(fā)的種子用2,3,5-三苯基氯化四唑(TTC)檢測種子活力。

1) 室內干藏(后熟)

將剛收獲的種子于室溫下干藏,分別檢測貯藏0(剛采收),3,6,9,12個(gè)月種子的萌發(fā)率。培養皿置于15 ℃/2 ℃、20 ℃/10 ℃、25 ℃/15 ℃及30 ℃/15 ℃等溫變周期(12 h光照/12 h黑暗或全黑暗)條件下培養28 d。不同的溫度反映野外生境中一年四季的溫度變化,即5 ℃/2 ℃(11月),15 ℃/2 ℃(3—4月),20 ℃/10 ℃(5月、9—10月),30 ℃/15 ℃(6—8月);冬季生境中的溫度低于0 ℃,種子在該溫度下不會(huì )萌發(fā)。

2) 野外埋藏

本研究的目的是確定在野外打破休眠的時(shí)間以及埋藏的種子是否經(jīng)過(guò)休眠周期。2021年10月25日,將干藏1個(gè)月的種子裝入珍珠紗網(wǎng)袋中,共10袋。將網(wǎng)袋分別埋入盛滿(mǎn)土壤的塑料盆(深為15 cm,直徑為20 cm)的2 cm深處,然后將盆埋在新疆農業(yè)大學(xué)實(shí)驗地中,使種子經(jīng)歷野外自然溫度和土壤水分條件的變化。

2021年11月25日—2022年6月,每月定期從試驗地取回一個(gè)花盆于最適萌發(fā)溫度(15 ℃/2 ℃)和光照(12 h光照/12 h黑暗或全黑暗)條件下對種子進(jìn)行28 d的萌發(fā)試驗(2021年12月至翌年2月,積雪覆蓋除外)。

3) 冷層積

將剛收獲的種子置于直徑為120 mm裝有濕河沙的玻璃培養皿中,用錫紙包裹后置于4 ℃恒溫冰箱中層積0,4,6,8周。層積處理后,將種子置于最適萌發(fā)溫度(15 ℃/2 ℃)和光照(12 h光照/12 h黑暗或全黑暗)條件下連續培養28 d。

4) 赤霉素對種子萌發(fā)的影響

將干藏的種子定時(shí)(時(shí)間隨干藏處理而定)分別取回,置于不同濃度(0,100,300,500,700 mol/L)的赤霉素溶液中浸泡24 h后,在最適萌發(fā)溫度(15 ℃/2 ℃)和光照(12 h光照/12 h黑暗或全黑暗)條件下培養28 d。

1.2.4數據處理

采用SPSS 26軟件對所得數據在95%水平上通過(guò)二因素方差分析(Two-way ANOVA)或三因素方差分析(Three-way ANOVA)檢驗差異的顯著(zhù)性,萌發(fā)結果以百分率±標準誤表示,圖表采用GraphDad Prism 9軟件繪制。

2.1 種子的形態(tài)指標和千粒重測定

刺山柑種子腎形,成熟種子為深棕色或黑褐色,長(cháng)(2.4±0.2)mm,寬(1.7±0.2)mm,厚(1.4±0.2)mm,千粒重(3.931 6±0.096 2)g(圖1),種子小且種皮厚。

圖1 刺山柑果實(shí)(A)、成熟果實(shí)(B)、種子(C～D)

2.2 種子的吸水實(shí)驗

完整的刺山柑種子吸水速度較慢,在水中浸泡12 h其重量?jì)H增加(24.48±1.44)%,種子的吸水于第4天才開(kāi)始穩定,增重(37.5±1.77)%,達到飽和狀態(tài)(圖2)。表明刺山柑種子吸水較慢且吸水較少。

圖2 刺山柑種子的吸水曲線(xiàn)

2.3 干藏對刺山柑種子萌發(fā)的影響

三因素方差分析結果(表1)表明,光照、干藏時(shí)間、光照與溫度的交互作用及其光照、溫度與干藏時(shí)間的交互作用對種子萌發(fā)無(wú)顯著(zhù)性影響,其他因素對種子萌發(fā)均有顯著(zhù)性影響?；盍z測后發(fā)現,98%未萌發(fā)種子是有活力的。

表1 室內干藏條件下,光照、溫度、干藏時(shí)間及其交互作用對刺山柑種子萌發(fā)影響的三因素方差分析

預實(shí)驗結果表明,刺山柑種子在5 ℃/2 ℃條件下不萌發(fā),故該溫度在干藏實(shí)驗中去除。15 ℃/2 ℃為種子的最佳萌發(fā)溫度,除干藏試驗外,其他萌發(fā)試驗均于該溫度下進(jìn)行。

新收獲的種子在各溫度和光照條件下不萌發(fā)或有較低的萌發(fā)率,剛收獲的成熟種子在15 ℃/2 ℃溫度下具有較高且穩定的萌發(fā)率。種子的萌發(fā)率并沒(méi)有隨著(zhù)室內干藏時(shí)間的延長(cháng)而發(fā)生顯著(zhù)性變化(圖3),最大萌發(fā)率出現在干藏的第3個(gè)月,在15/2 ℃的光照和全黑暗條件下分別達(52.00±11.31)%和(55.00±18.29)%。說(shuō)明干藏處理不能解除刺山柑種子的休眠。

注:不同小寫(xiě)字母表示相同儲藏時(shí)間在不同溫變梯度下萌發(fā)率存在差異顯著(zhù)(p<0.05)。

2.4 野外埋藏對刺山柑種子萌發(fā)的影響

二因素方差分析結果(表2)表明,光照、光照與埋藏時(shí)間的交互作用對種子的萌發(fā)率沒(méi)有顯著(zhù)影響,埋藏時(shí)間對種子的萌發(fā)率有顯著(zhù)影響。

表2 光照和埋藏時(shí)間及其交互作用對刺山柑種子萌發(fā)影響的二因素方差分析

野外自然溫度下,隨著(zhù)埋藏時(shí)間的延長(cháng),種子的萌發(fā)率逐漸提高(圖4)。埋藏的第6個(gè)月,種子的萌發(fā)率在各光照條件下分別達到(90.00±1.15)%和(93.00±6.83)%,說(shuō)明埋藏能解除種子休眠。

圖4 刺山柑種子野外埋藏0,1,5,6個(gè)月在光照和黑暗及15 ℃/2 ℃溫變梯度下的最終萌發(fā)率

2.5 冷層積對刺山柑種子萌發(fā)的影響

二因素方差分析結果(表3)表明,光照、冷層積時(shí)間、光照與冷層積時(shí)間的交互作用對種子萌發(fā)率均有顯著(zhù)影響。

表3 光照和冷層積時(shí)間及其交互作用對刺山柑種子萌發(fā)影響的二因素方差分析

在4 ℃恒溫冰箱進(jìn)行冷層積處理后,種子萌發(fā)率隨層積時(shí)間的延長(cháng)而顯著(zhù)提高(圖5),在黑暗條件下的萌發(fā)率比光照條件下的稍高,說(shuō)明低溫層積能快速解除種子休眠。

圖5 刺山柑種子冷層積0,4,6,8周在光照和黑暗及15 ℃/2 ℃溫變梯度下的最終萌發(fā)率

2.6 赤霉素對刺山柑種子萌發(fā)的影響

三因素方差分析結果(表4)表明,光照和干藏時(shí)間的交互作用、光照與干藏時(shí)間和赤霉素濃度的交互作用對種子萌發(fā)率無(wú)顯著(zhù)影響。光照、干藏時(shí)間、赤霉素濃度、光照與干藏時(shí)間的交互作用、干藏時(shí)間與赤霉素濃度的交互作用對種子萌發(fā)率有顯著(zhù)影響。

表4 室內干藏條件下,光照、干藏時(shí)間、赤霉素及其交互作用對刺山柑種子萌發(fā)影響的三因素方差分析

室內干藏的種子經(jīng)不同濃度赤霉素浸泡24 h后,在黑暗環(huán)境中有較高的萌發(fā)率,萌發(fā)率隨干藏時(shí)間的增加呈先增加后減少的趨勢(圖6)。除第6個(gè)月外,其余處理的萌發(fā)率在赤霉素濃度為300 mg/L時(shí)相對較高且穩定,第9個(gè)月萌發(fā)率在光照和黑暗條件下均最大,分別為(55.00±3.416)%和(65.00±3.41)%。結果表明,赤霉素處理能明顯提高種子萌發(fā)率,300 mg/L 赤霉素+黑暗條件為該處理下的最佳萌發(fā)方案。

注:圖中不同小寫(xiě)字母表示相同儲藏時(shí)間在不同赤霉素濃度梯度下萌發(fā)率存在顯著(zhù)差異(p<0.05)。

休眠是指整個(gè)植物或植物器官以生長(cháng)和發(fā)育的暫時(shí)停止為特征的一種狀態(tài)[21]。目前國際上認可的種子休眠類(lèi)型有五類(lèi),分別是物理休眠(PY)、形態(tài)休眠(MD)、生理休眠(PD)、生理形態(tài)休眠(MPD)和組合休眠(PY+PD)[20]。刺山柑種子因種皮特性引起休眠的報道較多[3,5,10,12,16,22],但本研究結果表明,刺山柑的種子具有一定的吸水能力,這與Foschi等[11]的研究結果一致,表明水分不是限制刺山柑萌發(fā)的主要因素,即刺山柑種子不存在物理休眠。刺山柑種子不易吸水有兩種原因:一是刺山柑種子的種皮木質(zhì)化,只能從種臍吸水;二是種子內脂肪含量高達30%[19,23]。另外,在一年的干藏實(shí)驗中,刺山柑種子的萌發(fā)率在各溫變周期均無(wú)顯著(zhù)提高,說(shuō)明種子不存在后熟現象,即刺山柑種子不存在形態(tài)休眠。綜上所述,刺山柑種子存在生理休眠。生理休眠又分為深度生理、中度生理和非深度生理休眠[24],本研究中,通過(guò)赤霉素處理和低溫層積8周均可顯著(zhù)提高刺山柑種子萌發(fā)率,說(shuō)明刺山柑屬于非深度生理休眠。

溫度對種子有重要的生理作用。溫度不僅可以改變種子的休眠狀態(tài),即低溫或高溫層積可解除種子的休眠狀態(tài)。輪葉碎米薺(Cardamineconcatenata)種子在5 ℃冷層積28周后萌發(fā)率達到98%;在30 ℃/15 ℃溫度條件下進(jìn)行4周暖層積預處理后于5 ℃下冷層積(持續50周),萌發(fā)率可達100%[25]。本研究結果表明,低溫層積可顯著(zhù)提高刺山柑種子的萌發(fā)率,僅層積8周便可解除休眠,萌發(fā)率達90%。此外,溫度還會(huì )影響無(wú)休眠種子的萌發(fā)速率,種子在萌發(fā)過(guò)程中代謝反應活躍,在一定的溫度范圍內,種子的萌發(fā)進(jìn)程隨溫度的升高而加快。大多數種子在變溫條件下的萌發(fā)率較恒溫條件下高。變溫可加快酶的催化作用,促進(jìn)貯藏物質(zhì)的轉化,其次變溫利于種殼軟化,利于種胚突破種皮,促進(jìn)萌發(fā)。Hypericumericoides在12 ℃/20 ℃變溫條件下萌發(fā)率幾乎達100%。變溫還有助于幼苗建成,如沙芥和斧翅沙芥種子在黑暗和20 ℃/30 ℃變溫條件下有利于種子萌發(fā)和幼苗建成[26]。李欣勇等[27]對風(fēng)車(chē)草種子的萌發(fā)特性研究發(fā)現,恒溫和變溫條件下的萌發(fā)率有顯著(zhù)差異,恒溫下的萌發(fā)率顯著(zhù)低于變溫。不同物種的種子最適萌發(fā)溫度有差異,種子萌發(fā)的最適溫度與植物各自的生境有密切關(guān)系。本研究結果表明,刺山柑種子經(jīng)4 ℃低溫冷層積處理后,萌發(fā)率迅速提高,且15 ℃/2 ℃的溫變周期為刺山柑種子最適萌發(fā)溫度。

在荒漠或半荒漠地區,不同植物種子的萌發(fā)對光照有不同的要求。雀麥屬(Bromus)植物種子在萌發(fā)時(shí)并不需要光照[28],而油蒿的瘦果在光照條件下萌發(fā),在暗條件下萌發(fā)受到抑制[29]。許多荒漠植物的種子在光照和黑暗條件下萌發(fā)都很好,部分在暗中的萌發(fā)較在光下好,如梭梭種子[30]。本研究結果表明,干藏、埋藏處理的種子萌發(fā)率在光照和黑暗條件下均無(wú)顯著(zhù)性差異,層積和赤霉素處理的種子在黑暗條件下萌發(fā)較光照下好,說(shuō)明刺山柑種子的萌發(fā)對光照沒(méi)有嚴格要求,在黑暗條件下較光下稍好。這與馬生軍等[31]對刺山柑發(fā)芽條件研究的結果一致。

刺山柑作為一種落葉小灌木,在自然生境中,5月始花,6—9月生產(chǎn)果實(shí),果熟期為1個(gè)月,10月植株的地上部分死亡。因此,在2021年9月采集當年的種子進(jìn)行實(shí)驗,采集過(guò)程中并未發(fā)現掉落的種子有出苗現象,于當年10月將刺山柑種子埋藏于試驗地中,經(jīng)6個(gè)月野外埋藏的刺山柑種子全在網(wǎng)袋中萌發(fā)。埋藏通過(guò)調節土壤濕度和溫度調節種子萌發(fā),冬季野外生境溫度低于0 ℃,大雪消融后取回埋藏的刺山柑種子進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗,發(fā)現其萌發(fā)率得到顯著(zhù)提高,并在4月達到90%以上。綜上,該處理等同于低溫層積處理打破種子休眠,這與Gulizebo等[8]的研究結果一致。

赤霉素(GA)是一種調控植物許多關(guān)鍵生理過(guò)程(如種子萌發(fā)、根和莖的伸長(cháng)、開(kāi)花、坐果和種子發(fā)育)的重要激素。GA能取代一些種子對低溫后熟的需求,通?？山獬N子的淺度生理休眠。外源添加赤霉素可直接提高其種子內部赤霉素含量,促進(jìn)種子萌發(fā)。休眠的石生茶藨(Ribessaxatile)種子經(jīng)低溫層積30 d后使用300 mg/L的GA3溶液處理2 h,萌芽率可高達82.67%[32]。然而,GA對解除生理休眠的作用因種而異。GA處理對美國梧桐(Acerpseudoplantanus)種子的萌發(fā)率沒(méi)有顯著(zhù)提高,而細胞分裂素能夠提高45%[33]。本研究結果表明,GA3處理能顯著(zhù)提高刺山柑種子萌發(fā)率,300 mg/L的GA處理下,刺山柑種子萌發(fā)率較高且穩定,這與Bahrani等[7]的研究結果一致。

1) 刺山柑種子存在非深度生理休眠;

2) 種皮具透水性;

3) 最適萌發(fā)溫度為15 ℃/2 ℃;

4) 光照不是刺山柑種子萌發(fā)的必要條件;

5) 可通過(guò)低溫層積打破休眠,赤霉素能顯著(zhù)提高其萌發(fā)率。