楊新根王艷龍鄒波常文英侯玉趙悠悠王庭林*張健旭
（1山西農業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，農業(yè)有害生物綜合治理山西省重點(diǎn)實(shí)驗室，太原 030031）（2山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，應用生物學(xué)研究所，太原 030006）（3定襄縣林草事務(wù)中心，定襄 035400）（4太原海關(guān)技術(shù)中心，臨汾 043000）（5中國科學(xué)院動(dòng)物研究所，農業(yè)蟲(chóng)害鼠害綜合治理研究國家重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 100101）（6中國科學(xué)院大學(xué)生物互作卓越創(chuàng )新中心，北京 100049）
作為世界上種類(lèi)和數量最多的哺乳動(dòng)物，嚙齒類(lèi)動(dòng)物廣泛分布于家居(家棲類(lèi))和自然環(huán)境(野棲類(lèi))中(鄭智民等，2008)。一直以來(lái)，人類(lèi)受到嚙齒動(dòng)物的危害涉及農、林、牧業(yè)和衛生保健等多個(gè)方面(Himsworthet al.,2013;Gryseelset al.,2015;Joneset al.,2017；
王金枝等，2020)，為此，人類(lèi)不得不應用多種手段防控嚙齒動(dòng)物種群。1950年以來(lái)，抗凝血滅鼠劑(殺鼠靈、氯鼠靈、殺鼠醚等第一代抗凝血劑)因其方便、安全和對環(huán)境的影響較小等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用(Bentley,1972;Sadler,2004;Ishizukaet al.,2008)。然而，第一代抗凝血滅鼠劑使用后不久嚙齒類(lèi)動(dòng)物開(kāi)始產(chǎn)生抗藥性(Boyle,1960;Greaves,1967;Greaves and Rennison,1973)?！俺壚鲜蟆钡某霈F促進(jìn)了第二代抗凝血滅鼠劑(溴敵隆、大隆、鼠敵克和氟鼠靈)的大量使用(Redfern and Gill,1980;Petterino and Paolo,2001;Gouloiset al.,2017)，但很快在一些國家發(fā)現了對其產(chǎn)生抗藥性的嚙齒動(dòng)物(Roweet al.,1981;Kohnet al.,2003;Huanget al.,2011)。我國于1980年后開(kāi)始在家居和自然環(huán)境中廣泛使用抗凝血滅鼠劑(董天義，2001)，并在小家鼠(Mus musculus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)和黃胸鼠(Rattus tanezumi)等家棲鼠種群中產(chǎn)生了抗藥性(張世炎等，2002；
易建榮等，2005)，但很少有研究關(guān)注野棲類(lèi)嚙齒動(dòng)物的抗藥性(Wanget al.,2008；
高志祥等，2008)。
抗凝血滅鼠劑的作用機理是特異性抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶復合物(vitamin K epoxide reductase,VKOR)，進(jìn)而阻止維生素K循環(huán)(Helgeland,1977;Thijssenet al.,2004)。2004年，維生素K環(huán)氧化物還原酶復合物亞基1(vitamin K epoxide reductase complex,subunit 1,VKORC1)被鑒定和報道(Rostet al.,2004;Liet al.,2004)，嚙齒動(dòng)物對抗凝血殺鼠劑抗藥性的遺傳機制也逐步被闡明：Vkorc1基因中核苷酸的突變可能會(huì )改變VKORC1蛋白的結構，從而降低抗凝血劑與VKOR的結合效率(Buckle,2013)。根據前人的報道，多種VKORC1氨基酸突變可導致嚙齒動(dòng)物產(chǎn)生抗藥性，如 小 家 鼠 的Ala26Thr、Trp59Gly、Leu124Met、Leu128Ser和Tyr139Cys(Gouloiset al.,2017)，褐家鼠 的Val29Leu、Val45Ala、Arg58Gly、Leu128Arg和Tyr139Cys(Rostet al.,2004)，黃 胸 鼠 的Tyr139Cys(Huanget al.,2011)。這些研究無(wú)疑為我們開(kāi)展嚙齒動(dòng)物抗性監測奠定了理論依據。
長(cháng)尾倉鼠(Cricetulus longicaudatus)主要分布在中國東部和中部，蒙古國西部和中部，俄羅斯圖瓦、貝加爾湖地區和布里亞特南部的草原和半沙漠地區(Poplavskayaet al.,2018)。長(cháng)尾倉鼠是我國重要的優(yōu)勢野棲鼠種，在局部區域其占比達70%以上，可使農作物減產(chǎn)10%~15%(楊新根等，2019a)。黃胸鼠主要分布在東亞和東南亞地區，是一種常見(jiàn)的家棲鼠，也會(huì )在秋季遷移至田間危害農作物(Guoet al.,2019)。近年來(lái)，黃胸鼠隨著(zhù)物流網(wǎng)絡(luò )的日益發(fā)達已侵入南非和美國等地，嚴重威脅著(zhù)當地的生物安全和物種多樣性(Aplinet al.,2011;Bastoset al.,2011;Conroyet al.,2013)。一直以來(lái)，黃胸鼠被認為是只分布在我國南方省份的重要害鼠，直到20世紀90年代后，該物種入侵山西、陜西、河北等地并逐漸成為家棲鼠類(lèi)的優(yōu)勢種(張美文等，2000；
吳海霞等，2017；
楊新根等，2019b)。
鑒于抗凝血滅鼠劑在我國部分地區的大量使用，為了掌握鼠類(lèi)抗藥性的本底資料，為開(kāi)發(fā)嚙齒動(dòng)物抗藥性監測的分子標記提供基礎依據，本研究以山西省為研究區域(北緯34°34′~40°44′，東經(jīng)110°14′~114°33′)，在不同縣(市、區)捕獲黃胸鼠和長(cháng)尾倉鼠樣本，對其Vkorc1基因的編碼區進(jìn)行擴增和測序，分析其多態(tài)性并鑒定可能與抗藥性有關(guān)的變異位點(diǎn)，以期為掌握嚙齒動(dòng)物Vkorc1基因在家居和自然環(huán)境中的適應性進(jìn)化提供理論依據，并進(jìn)一步指導嚙齒動(dòng)物群落的抗性監測和防控工作。
本研究于2016—2018年5—11月，從山西省農田和養殖場(chǎng)采集樣本，所有程序均遵循《中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部實(shí)驗動(dòng)物管理條例》(2017年修訂)。
從山西省13個(gè)縣(市、區)的農田捕獲嚙齒動(dòng)物，分別為晉城市陵川縣(LIC)，臨汾市隰縣(XIX)和永和縣(YOH)，長(cháng)治市沁縣(QNX)，晉中市左權縣(ZOQ)，呂梁市中陽(yáng)縣(ZHY)和離石區(LIS)，太原市婁煩縣(LOF)和陽(yáng)曲縣(YAQ)，陽(yáng)泉市盂縣(YUX)，忻州市靜樂(lè )縣(JNL)和五臺縣(WUT)，大同市渾源縣(HNY)(表1，圖1A)。以花生、核桃和蘋(píng)果為誘餌，傍晚同時(shí)放置大號捕鼠夾和捕鼠籠，次日收回。夾(籠)距為5 m，行距大于20 m，捕鼠夾(籠)數量每日不少于300個(gè)，共計5 805個(gè)。
從山西省14個(gè)縣(市、區)的養殖場(chǎng)(養豬場(chǎng)和養雞場(chǎng))捕獲嚙齒動(dòng)物，分別為運城市永濟市(YOJ)、LIC、臨汾市洪洞縣(HOT)、XIX、QNX、ZOQ、晉中市祁縣(QIX)、LIS、太原市小店區(XID)、LOF、YUX、WUT、朔 州 市 朔 城 區(SOC)、HNY(表1，圖1B)。以花生、核桃和蘋(píng)果為誘餌，同時(shí)放置大號捕鼠夾和捕鼠籠，次日收回。捕鼠夾(籠)至少放置2 d，每天檢查并重新更換餌料。夾(籠)距為5 m，行距和捕鼠夾(籠)數量根據采樣點(diǎn)具體情況確定，共計布夾(籠)3 860個(gè)。
圖1 長(cháng)尾倉鼠和黃胸鼠采集地及樣本占比(山西省).A：長(cháng)尾倉鼠；
B：黃胸鼠.圖中采集地使用縮寫(xiě)，全稱(chēng)見(jiàn)表1.“×”表示未捕獲到黃胸鼠的采集地；
餅狀圖表示樣本在嚙齒動(dòng)物群落中的占比，紅色表示長(cháng)尾倉鼠，藍色表示黃胸鼠，白色表示其他嚙齒動(dòng)物Fig.1 The sampling sites and proportions of samples(Shanxi Province).A:Cricetulus longicaudatus;B:Ruttus tanezumi.Abbreviations are used for collection sites,see table 1 for collection sites.‘×’represent the sites that R.tanezumi was not captured;pie charts represent the proportions of samples,red for C.longicaudatus,blue for R.tanezumi,and white for other species
表1 樣本采集地概況Table 1 The collecting details of sample sites
計算每個(gè)縣(市、區)不同采樣生境(農田或養殖場(chǎng))的捕獲率：農田或養殖場(chǎng)捕獲率(%)=捕獲農田或養殖場(chǎng)嚙齒動(dòng)物總個(gè)體數/農田或養殖場(chǎng)布夾(籠)數×100；
計算長(cháng)尾倉鼠或黃胸鼠在嚙齒動(dòng)物群落中的占比：長(cháng)尾倉鼠或黃胸鼠占比(%)=捕獲長(cháng)尾倉鼠或黃胸鼠數/捕獲農田或養殖場(chǎng)嚙齒動(dòng)物總個(gè)體數。
剪取每只長(cháng)尾倉鼠和黃胸鼠個(gè)體的尾尖并放置于無(wú)水乙醇中，-80℃冰箱儲存，以備提取基因組DNA。
每個(gè)樣本基因組DNA的提取根據血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根，DP304)的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。DNA提取物在TE緩沖液中洗脫并儲存在-20℃環(huán)境中。
首先應用形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行物種的鑒別(鄭智民等，2008)。在此基礎上，采用基于細胞色素c氧化酶亞基I基因(cytochrome c oxidase subunit I,COI)的DNA條形碼技術(shù)以避免錯誤鑒別(Hebertet al.,2003)：應用通用引物BatL5310(5′-CCTACTCRGCCATTTTACCTATG-3′)和R6036R(5′-ACTTCTGGGTGTCCAAAGAATCA-3′)從每個(gè)樣本的基因組DNA中擴增COI基因片段，PCR(BioR Technology,G1000)反應體系包括1.5 μL基因組DNA模板(30~50 ng)，12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix(天根，KT201)，9 μL雙蒸水和上下游引物各1 μL。擴增條件如下：95℃預變性5 min；
95℃變性45 s，54℃退 火1 min，72℃延 伸1 min，循 環(huán)35次；
72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送至上海派森諾生物技術(shù)有限公司測序。
應用MEGA X軟件包中的Muscle軟件，對測序所得COI序列與已發(fā)表長(cháng)尾倉鼠COI序列(GenBank編號KC709682.1)和黃胸鼠COI序列(GenBank編號NC_011638.1)進(jìn)行比對(Edgar,2004)，COI序列差異度小于2%為同一物種(Hebertet al.,2003)。
鑒于Vkorc1基因共含有3個(gè)外顯子，本研究根據GenBank中已發(fā)表的灰倉鼠(Cricetulus griseus)(長(cháng)尾倉鼠的近緣種)和黃胸鼠Vkorc1基因序列(GenBank編號分別為NC_048596.1和FJ868832.1)，分別設計了兩組引物(表2)。所有Vkorc1基因的擴增均在PCR儀(BioR Technology,G1000)中進(jìn)行，反應體系含有1.5 μL基因組DNA模板(30~50 ng)，12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix(天根，KT201)，9 μL雙蒸水和上下游引物各1 μL。PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。
長(cháng)尾倉鼠第一組引物C.l.-Vk1/F/e1-2和C.l.-Vk1/R/e1-2用于將Vkorc1基因從核苷酸(-)113[Vkorc1基因外顯子1中的第一個(gè)核苷酸編號為(+)1，黃胸鼠同]擴增至核苷酸(+)1231(包含外顯子1和2)，第二組引物C.l.-Vk1/F/e3和C.l.-Vk1/R/e3用于將Vkorc1基因從核苷酸(+)1810擴增至核苷酸(+)2316(包含外顯子3)(表2)。PCR反應條件如下：94℃預變性5 min；
94℃變性30 s，58℃(第一組引物)或60℃(第二組引物)退火30 s，72℃延伸100 s，35次循環(huán)；
72℃延伸5 min。
對于黃胸鼠，第一組引物R.t.-Vk1/F/e1-2和R.t.-Vk1/R/e1-2用于將Vkorc1基因從核苷酸(-)167擴增至核苷酸(+)1278(包含外顯子1和2)，第二組引物R.t.-Vk1/F/e3和R.t.-Vk1/R/e3用于將Vkorc1基因從核苷酸(+)1789擴增至核苷酸(+)2175(包含外顯子3)(表2)。PCR反應條件如下：94℃預變性5 min；
94℃變性30 s，58℃(第一組引物)或60℃(第二組引物)退火30 s，72℃延伸100 s，35次循環(huán)；
72℃延伸5 min。
表2 長(cháng)尾倉鼠和黃胸鼠Vkorc1基因編碼區的特異性引物序列Table 2 Specific primer sequences for the coding regions of Vkorc1 of Cricetulus longicaudatus and Ruttus tanezumi
應用MEGA X軟件包中的Muscle軟件(Edgar,2004)，分 別 以 灰 倉 鼠(GenBank編 號NC_048596.1)和黃胸鼠(GenBank編號FJ868832.1)Vkorc1基因序列為參考，比對擴增成功的長(cháng)尾倉鼠和黃胸鼠Vkorc1基因外顯子序列，手動(dòng)檢測并記錄Vkorc1基因編碼區的變異位點(diǎn)，計算攜帶不同變異位點(diǎn)的個(gè)體在種群中的占比。
應用SPSS 20.0對不同錯義突變位點(diǎn)的分布頻數進(jìn)行χ2檢驗，比較錯義突變位點(diǎn)在不同縣(市、區)的差異，P＜0.05為差異有統計學(xué)意義。
本研究共在山西省的18個(gè)縣(市、區)捕獲嚙齒動(dòng)物613只(表3)。在農田和果園中，共捕獲511只嚙齒動(dòng)物(未捕獲到黃胸鼠)，LIS捕獲率最低(6.85%)，XIX最高(14.77%)；
在養殖場(chǎng)共捕獲102只家棲類(lèi)嚙齒動(dòng)物，HNY捕獲率最低(0.37%)，LIC最高(7.22%)(表3)。
經(jīng)形態(tài)學(xué)標準和DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行物種鑒別后，長(cháng)尾倉鼠在采樣的13個(gè)縣(市、區)的農田中均有捕獲，共捕獲119只個(gè)體，占野棲類(lèi)嚙齒動(dòng)物的23.29%，表明該物種在農田中的優(yōu)勢鼠種地位(表3，圖1A)。在采樣的山西省14個(gè)縣(市、區)的養殖場(chǎng)中，黃胸鼠呈條帶狀分布，共在8個(gè)縣(市、區)有所捕獲，分別為YOJ、LIC、HOT、QNX、QIX、LIS、XID和WUT，而 在XIX、ZOQ、LOF、YUX、SOC和HNY未捕獲到黃胸鼠；
共捕獲黃胸鼠個(gè)體70只，占家棲類(lèi)嚙齒動(dòng)物的68.63%，表明該物種在分布區域的優(yōu)勢種地位(表3，圖1B)。
表3 嚙齒動(dòng)物捕獲率及樣本占比Table 3 The sampling sites and the trapping details of rodents
本研究共獲得105只長(cháng)尾倉鼠個(gè)體Vkorc1基因3個(gè)外顯子的全序列，在外顯子中共檢測到11個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)(表4)。其中，沉默突變位點(diǎn)有6個(gè)，分別是外顯子1中的G78A(C)(Ala26Ala)、G135A(Val45Val)和C159A(Arg53Arg)，外顯子2中的C222T(Ser74Ser)，外顯子3中的C342T(Phe114 Phe)和C438T(His146His)；
有5個(gè)錯義突變位點(diǎn)，分別為外顯子1中的C8T(Thr3Ile)和G106A(Asp36Asn)，外 顯 子2中 的A203G(His68Arg)和A203T(His68Leu)，外顯子3中的G346A(Gly116 Ser)(表4)。在沉默突變位點(diǎn)中，外顯子3中C438T(His146His)的變異率最高，為67.62%，其次為C342T(Phe114Phe)的28.57%，外顯 子1中 的G135A(Val45Val)變異率最低，為8.57%(表4)。在錯義突變位點(diǎn)中，檢測到10只長(cháng)尾倉鼠個(gè)體有錯義突變A203G(His68Arg)，突變率為9.52%；
9只個(gè)體(8.57%)檢測到C8T(Thr3Ile)；
3只個(gè)體(2.86%)有G106A(Asp36Asn)；
2只個(gè)體(1.90%)有A203T(His68Leu)；
1只個(gè)體有G346A(Gly116Ser)(表4)。
獲得70只黃胸鼠個(gè)體Vkorc1基因3個(gè)外顯子的全系列，在外顯子中共檢測到7個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)(表4)。其中6個(gè)為沉默突變位點(diǎn)，分別為外顯子1中 的A36G(Arg12Arg)和G123A(Ala41Ala)，外 顯 子2中 的T204C(His68His)和A246T(Ile82Ile)，外 顯 子3中 的A321C(Ile107Ile)和T411C(Thr137Thr)(表4)；
錯義突變位點(diǎn)有1個(gè)，為外顯子3中的A416G導致氨基酸變異Tyr139Cys(表4)。在所有沉默突變位點(diǎn)中，變異率最高的為外 顯 子3中 的A321C(Ile107Ile)和T411C(Thr137Thr)，變異率為18.57%；
變異率最低的為外顯子2中的A246T(Ile82Ile)，僅檢測到3只個(gè)體(4.29%)(表4)。共在8只個(gè)體中檢測到錯義突變位點(diǎn)A416G(Tyr139Cys)，變異率為11.43%(表4)。
表4 長(cháng)尾倉鼠和黃胸鼠Vkorc1編碼區變異位點(diǎn)Table 4 The mutation positions in coding regions of Vkorc1 gene of Cricetulus longicaudatus and Ruttus tanezumi
分析不同錯義突變位點(diǎn)在各縣(市、區)分布頻數的差異性。在長(cháng)尾倉鼠種群中，錯義突變位點(diǎn)C8T(Thr3Ile)在不同縣(市、區)的分布頻數有顯著(zhù)差異(P=0.003)，其中，該突變在LIC和HNY的分布頻數顯著(zhù)高于其他縣(市、區)；
位點(diǎn)G106A(Asp36Asn)的分布頻數無(wú)顯著(zhù)差異(P=0.349)；
位點(diǎn)A203G(His68Arg)的分布頻數具統計學(xué)意義(P＜0.001)，其在LIC的分布頻數顯著(zhù)高于其他縣(市、區)；
位點(diǎn)A203T(His68Leu)在不同縣(市、區)的分布頻數有顯著(zhù)差異(P=0.015)，其在XIX的分布頻數顯著(zhù)高于其他縣(市、區)；
位點(diǎn)G346A(Gly116Ser)的分布頻數在不同縣(市、區)無(wú)顯著(zhù)差異(P=0.530)。在黃胸鼠種群中，錯義突變位點(diǎn)A416G(Tyr139Cys)的分布頻數在不同縣(市、區)有顯著(zhù)差異(P=0.019)，其中，該位點(diǎn)在XID和QIX的分布頻數無(wú)顯著(zhù)差異(P=0.528)，在XID的分布頻數顯著(zhù)高于除QIX外的其他縣(市、區)。
分析攜帶Vkorc1基因變異位點(diǎn)的長(cháng)尾倉鼠個(gè)體在各采樣地的分布，所有13個(gè)采樣地的個(gè)體均含有Vkorc1基因變異位點(diǎn)，其中，LIC、XIX、ZOQ、ZHY、LOF、YAQ、YUX和HNY的樣本含有錯義突變個(gè)體，YOH、QNX、LIS、JNL和WUT的樣本只含有沉默突變位點(diǎn)，僅檢測到來(lái)自YOH、QNX、YUX、LOF和JNL的10個(gè)非變異樣本(圖2)。在含有錯義突變個(gè)體的采樣地中，LIC的樣本錯義突變率最高，為71.43%，其次為XIX樣本的37.50%(圖2)。
圖2 長(cháng)尾倉鼠不同類(lèi)型Vkorc1基因變異個(gè)體在各采樣地的變異率.NM：無(wú)變異位點(diǎn)；
SM：含沉默突變位點(diǎn)；
MM：含錯義突變位點(diǎn)Fig.2 The mutation rate of Vkorc1 mutatants about Cricetulus longicaudatus in each sampling sites.NM:Non-mutatants;SM:Silent mutatants;MM:Missense mutatants
變異率最高的沉默突變C438T(His146His)共出現在71個(gè)樣本中，且在所有13個(gè)采樣地均有分布。共在17個(gè)樣本中檢測到錯義突變，其中，LIC的1個(gè) 樣 本 同 時(shí) 含 有Thr3Ile、Asp36Asn和His68Arg 3種雜合錯義突變位點(diǎn)，LIC的2個(gè)樣本、HNY的2個(gè) 樣 本、ZOQ的1個(gè)樣本和ZHY的1個(gè)樣本同時(shí)含有Thr3Ile和His68Arg 2種錯義突變位點(diǎn)。Thr3Ile的變異體來(lái)自6個(gè)采樣地(LIC、XIX、ZOQ、ZHY、YAQ和HNY)，Asp36Asn的3個(gè)突變體分別來(lái)自L(fǎng)IC、ZOQ和LOF，His68Arg的變異體來(lái)自5個(gè)采樣地(LIC、XIX、ZOQ、ZHY和HNY)，His68Leu僅 在XIX檢 測 到，Gly116Ser僅出現在YUX。
黃胸鼠樣本中，除YOJ、LIC和QNX外，在HOT、QIX、LIS、XID和WUT中共檢測到22個(gè)樣本存在Vkorc1基因變異位點(diǎn)，占31.43%。在XID的樣本中，檢測到所有的7個(gè)變異位點(diǎn)，在QIX共檢測到5個(gè)，在HOT、LIS和WUT中檢測到4個(gè)。對于錯義突變Tyr139Cys，8個(gè)變異體中有7個(gè)來(lái)自XID，1個(gè)來(lái)自QIX，其變異率分別為35.00%和16.67%(圖3)。
圖3 黃胸鼠不同類(lèi)型Vkorc1基因變異個(gè)體在各采樣地的變異率.NM：無(wú)變異位點(diǎn)；
SM：含沉默突變位點(diǎn)；
MM：含錯義突變位點(diǎn)Fig.3 The mutation rate of Vkorc1 mutatants about Ruttus tanezumi in each sampling sites.NM:Non-mutatants;SM:Silent mutatants;MM:Missense mutatants
在山西省，因長(cháng)尾倉鼠在農田的優(yōu)勢種地位(本研究13個(gè)采樣點(diǎn)均有捕獲，相對占比23.29%)，成為了抗凝血滅鼠劑在農田化學(xué)防治工作中的重要靶標物種(楊新根等，2019a)。20世紀90年代之前，黃胸鼠僅分布于長(cháng)江以南諸省，與農業(yè)和公共衛生均密切相關(guān)(張美文等，2004)。近年來(lái)，黃胸鼠的持續北擴可能與氣候變暖和物流網(wǎng)絡(luò )的高速發(fā)展有密切關(guān)系，使我們不得不擔心其對公共衛生和生物安全的影響(Plyusninaet al.,2009;Blasdellet al.,2011;Huanget al.,2013)。從采樣結果看，黃胸鼠現階段呈條帶狀分布于五臺縣以南的家居環(huán)境中，這可能與黃胸鼠借助交通工具的擴散方式有關(guān)，加之需逐步適應北方的低溫環(huán)境，因此在山西省其很少對農作物造成危害。另外，在山西省黃胸鼠已占家棲類(lèi)嚙齒動(dòng)物的68.63%，在其分布區域處于明顯優(yōu)勢種地位，已對當地原家棲類(lèi)嚙齒動(dòng)物(褐家鼠和小家鼠)造成了較大的威脅。在我國，抗凝血滅鼠劑用于室內和田間鼠害防治已有近40年的歷史(董天義，2001)，然而，抗藥性嚙齒動(dòng)物的出現嚴重阻礙了該類(lèi)滅鼠劑的有效性?？鼓獪缡髣┑拇罅渴褂脤ι鷳B(tài)系統也有很大影響。有研究表明，抗凝血滅鼠劑對非靶標動(dòng)物具有較高的暴露風(fēng)險，甚至會(huì )導致抗藥性(Christensenet al.,2012;Geduhnet al.,2016;St?cket al.,2019)。
Vkorc1基因的核苷酸變異改變了嚙齒動(dòng)物對抗凝血滅鼠劑的反應，因此，其變異位點(diǎn)常被用作檢測和監測抗藥性嚙齒動(dòng)物的分子標記(Díazet al.,2010)。研究表明，在農田中較低的選擇壓力、較低的空間藥劑濃度及其棲息環(huán)境的易變性，使嚙齒類(lèi)動(dòng)物的抗藥性通常很難在田間檢測到(Buckle and Smith,1994)，但毋庸置疑，抗凝血滅鼠劑的長(cháng)期使用使野外嚙齒類(lèi)動(dòng)物對其產(chǎn)生抗性(Veinet al.,2011)。本研究在長(cháng)尾倉鼠Vkorc1基因編碼區共檢測到11種不同的變異位點(diǎn)，包括5個(gè)錯義突變位點(diǎn)和6個(gè)沉默突變位點(diǎn)。研究證實(shí)錯義突變位點(diǎn)His68Asn會(huì )導致黑家鼠(Rattus rattus)的Ki催化活性降低(Marquezet al.,2019)，本文在長(cháng)尾倉鼠Vkorc1基因檢測到的5種錯義突變位點(diǎn)Thr3Ile、Asp36Asn、His68Arg、His68Leu和Gly116Ser是否與抗藥性有關(guān)，還需從酶動(dòng)力學(xué)、蛋白結構與功能等生化領(lǐng)域深入研究和闡明，以評估其編碼的VKORC1酶對抗凝血滅鼠劑的敏感性。但不可否認，高頻率用藥的縣(市、區)常具有Vkorc1基因的高突變率：在LIC和XIX(兩縣曾持續多年應用抗凝血滅鼠劑對農田害鼠進(jìn)行高頻率防控)，錯義突變位點(diǎn)Thr3Ile(LIC)、His68Arg(LIC)和His68Leu(XIX)的分布頻率顯著(zhù)高于其他縣(市、區)。
錯義突變A416G(Tyr139Cys)是檢測抗藥性的重要分子標記之一，在對殺鼠靈和溴敵隆產(chǎn)生抗性的小家鼠、黃胸鼠、黑家鼠和褐家鼠中已有報道(Pelzet al.,2005;Huanget al.,2011;Gouloiset al.,2017)。139位點(diǎn)上的氨基酸突變被認為是疏水性Thr-Tyr-Ala(138-139-140)序列中結合抗凝血滅鼠劑的關(guān)鍵位置(Rostet al.,2005)。本研究在黃胸鼠種群中檢測到的7個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)，包括6個(gè)沉默突變位點(diǎn)和1個(gè)Tyr139Cys錯義突變位點(diǎn)。根據檢測結果，8只出現了A416G(Tyr139Cys)變異位點(diǎn)的黃胸鼠已對抗凝血滅鼠劑產(chǎn)生了抗藥性，其中，QIX的6只黃胸鼠樣本中的1只存在A(yíng)416G(Tyr139Cys)變異位點(diǎn)，因樣本量較小，尚無(wú)法確定QIX是否存在黃胸鼠的抗性種群；
XID種群中7只個(gè)體存在A(yíng)416G(Tyr139Cys)變異位點(diǎn)，占比達35.00%，說(shuō)明在XID已經(jīng)產(chǎn)生了黃胸鼠抗性種群，需加強對此種群的監測(董天義，2001)。
盡管沉默突變不會(huì )影響VKORC1蛋白酶的結構及其性質(zhì)，也不影響嚙齒動(dòng)物的抗藥性，但目前尚無(wú)法確定這些沉默突變是否會(huì )影響其翻譯效率，以及是否與藥物選擇下的基因進(jìn)化有關(guān)(Andruet al.,2013)。在本研究檢測到的沉默突變中，長(cháng)尾倉鼠變異率最高的為C438T(His146His)(外顯子3)，占67.62%，黃胸鼠最常見(jiàn)變異位點(diǎn)為A321C(Ile107Ile)和T411C(Thr137Thr)(外顯子3)，變異率為18.57%(表4)。這些沉默突變位點(diǎn)是否與大量使用抗凝血滅鼠劑有關(guān)，尚待在未來(lái)的研究中進(jìn)行驗證。
自然界中一些嚙齒動(dòng)物具有天然抗性，但更多的嚙齒動(dòng)物是后天在抗凝血類(lèi)滅鼠劑的選擇脅迫下產(chǎn)生的適應性抗性。人類(lèi)雖然在嚙齒動(dòng)物Vkorc1基因多態(tài)性研究方面取得了一些成果，但相對于龐大的嚙齒動(dòng)物群落而言，仍需要廣大科研工作者的持續關(guān)注和研究。
綜上，本研究通過(guò)分析長(cháng)尾倉鼠和黃胸鼠種群Vkorc1基因的多態(tài)性，明確了山西省長(cháng)尾倉鼠種群中存在5種錯義突變，這些錯義突變是否與長(cháng)尾倉鼠的抗藥性有關(guān)，需進(jìn)一步地深入研究和闡明；
黃胸鼠中存在與其抗藥性密切相關(guān)的A416G(Tyr139Cys)錯義突變，且已在太原市小店區形成抗性種群，需加強對此種群的監測；
鑒于沉默突變在兩物種中的高變異率，其是否與藥物選擇下的基因進(jìn)化有關(guān)，尚待在未來(lái)的研究中進(jìn)行驗證。本研究可以為開(kāi)發(fā)嚙齒動(dòng)物抗藥性監測的分子標記提供基礎資料，進(jìn)一步為嚙齒動(dòng)物的監測預警和科學(xué)制定區域性綜合防控措施提供理論依據。
