幾種誘抗劑對西瓜ZYMV,的防治效果評價(jià)

郝小苑，劉卓文，劉楓楠，劉莉銘，吳會(huì )杰，古勤生，康保珊，2*

（1 中國農業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所，河南省果樹(shù)瓜類(lèi)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，河南鄭州 450009；
2 中國農業(yè)科學(xué)院中原研究中心，河南新鄉 453500）

病毒性病害是農作物病害中一類(lèi)特殊的病害，其傳播快、防治難，號稱(chēng)“植物癌癥”，植物感染病毒病后主要癥狀表現為花葉、枯斑、壞死、畸形、黃化等。病毒是專(zhuān)性寄生物，依賴(lài)寄主體內的蛋白進(jìn)行增殖、傳播，消耗寄主營(yíng)養，造成植物發(fā)育不良或畸形生長(cháng)。一般化學(xué)藥物很難抑制病毒的繁殖和運動(dòng)，目前國內尚無(wú)防治病毒病的理想農藥產(chǎn)品。

植物免疫誘抗劑又稱(chēng)植物疫苗，是近幾年發(fā)展的一類(lèi)新型生物農藥，包括蛋白多肽類(lèi)、寡糖類(lèi)、有機酸類(lèi)和無(wú)機化合物類(lèi)等（Qiu et al.，2017）。誘抗劑對農作物病蟲(chóng)害沒(méi)有直接的殺滅作用，是由外源生物或分子通過(guò)誘導或激活植物的免疫系統并調節植物的新陳代謝，改善植物的養分狀況，增強抵抗病蟲(chóng)害的能力，從而達到防病、抗病的目的。目前已有多種植物免疫誘抗劑在生產(chǎn)中應用。植物病原菌產(chǎn)生的蛋白Harpin 在1992 年被證實(shí)可以提高作物產(chǎn)量，改善作物生長(cháng)狀況，而且可以增強對病毒病的抗性和抵抗蚜蟲(chóng)侵害的能力（Wei et al.，1992；
Baker et al.，1993），之后研發(fā)出含該蛋白的顆粒生物制劑用于植物保護（Grisham，2000），并應用于多個(gè)國家的煙草、蔬菜以及水果種植中；
病原菌細胞壁的組成成分殼寡糖也是一種有效的天然植物免疫誘抗劑，被證明可以促進(jìn)植物生長(cháng)和對非生物脅迫的耐受性，以及提高多種作物的抗病性（Pichyangkura & Chadchawan，2015），目前已對殼寡糖及其衍生物進(jìn)行商業(yè)化規模生產(chǎn)。很多研究證明，免疫誘抗劑可以誘導植物產(chǎn)生系統獲得性抗性（SAR）（Bektas & Eulgem，2014），例如苯丙噻二唑（閆濤 等，2009；
Wei et al.，2011）、β-氨基丁酸（Hamiduzzaman et al.，2005）、殼寡糖（商文靜，2006）、水楊酸（Li et al.，2012）、單萜（Riedlmeier et al.，2017）等。隨著(zhù)食品安全和環(huán)境安全越來(lái)越受到人們的關(guān)注，作為綠色生物防治劑的植物免疫誘抗劑將會(huì )成為開(kāi)發(fā)和應用防治產(chǎn)品的新趨勢。

目前市場(chǎng)上還沒(méi)有專(zhuān)門(mén)針對葫蘆科作物尤其西瓜防治病毒病害的誘抗劑，而且由于不同寄主間免疫抗性機制的差異，當同種誘抗劑應用于不同作物及不同病害時(shí)，防治極可能無(wú)效。小西葫蘆黃花葉病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）引起的病害是西瓜生產(chǎn)中常見(jiàn)的病毒病害，危害非常嚴重，全球范圍內均有發(fā)生，是目前危害中國葫蘆科作物最主要的流行病害之一（古勤生，2002）。本研究針對西瓜ZYMV，開(kāi)展了6 種不同濃度和類(lèi)型的誘抗劑及其復配組合對ZYMV 的防治效果試驗，以期篩選出防效較好的化學(xué)誘抗劑組合，為瓜類(lèi)病毒病害的綠色防控提供依據。

1.1 植物材料與病毒

試驗于2021 年5—11 月在中國農業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所進(jìn)行。供試西瓜品種：紅和平，購自浙江勿忘農種業(yè)股份有限公司。將西瓜種子在水中浸泡6 h，用濕紗布包裹置于28 ℃培養箱中催芽，待芽長(cháng)出后播種于裝有營(yíng)養土的營(yíng)養缽中，每缽1粒，置于培養室中（23～27 ℃），常規管理，植株長(cháng)到兩葉一心時(shí)，待用。試驗期間西瓜幼苗的生長(cháng)和處理均在培養室中進(jìn)行。

ZYMV 侵染性克?。河芍袊r業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所西甜瓜病蟲(chóng)害防控實(shí)驗室采用ZYMVCH87 分離物構建（劉莉銘 等，2021）。

供試藥劑：殼寡糖購于北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司，沒(méi)食子酸（gallic acid，GA）購于生工生物工程（上海）股份有限公司，L-哌啶酸（Pip）購于上海賢鼎生物科技有限公司，β-氨基丁酸（BABA）購于上海麥克林生化科技股份有限公司，N-羥基哌啶酸（NHP）購于MCE 生物科技有限公司，2，1，3-苯丙噻二唑（BTH）購于西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司，阿泰靈購于河北中保綠農作物科技公司。

1.2 藥劑處理

將藥劑按照試驗濃度進(jìn)行配制，其中藥劑對照（CK+ ）溶液為阿泰靈粉末稀釋40 倍液。BABA溶液：先加入少量無(wú)水乙醇，待藥劑完全溶解后，加入蒸餾水配制成50 mmol · L-1的母液，4 ℃保存；
噴施前用蒸餾水稀釋成濃度梯度分別為5 mmol · L-1和1 mmol · L-1的工作液。BTH 溶液：先加入少量無(wú)水乙醇，待藥劑完全溶解后，加入蒸餾水配制成5 mmol · L-1母液，4 ℃保存；
噴施前用蒸餾水稀釋成濃度梯度分別為0.5 mmol · L-1和0.1 mmol · L-1的工作液。殼寡糖溶液：蒸餾水溶解，并在水浴鍋中加熱助溶，配制成5 g · L-1的母液，室溫保存；
噴施前用蒸餾水稀釋成濃度梯度分別為2.5 g · L-1和1 g · L-1的工作液。沒(méi)食子酸溶液：蒸餾水溶解，配制成1 g · L-1的母液，室溫保存；
噴施前用蒸餾水稀釋成濃度梯度分別為0.5 g · L-1和0.1 g · L-1的工作液。Pip 溶液：蒸餾水溶解，配制成100 mmol ·L-1的母液，4 ℃保存；
噴施前用蒸餾水稀釋成濃度分別為2 mmol · L-1和1 mmol · L-1的工作液。NHP溶液：蒸餾水溶解，配制成10 mmol · L-1的母液，-20℃保存；
噴施前用蒸餾水稀釋成濃度梯度分別為0.5 mmol · L-1和0.1 mmol · L-1的工作液。

西瓜幼苗兩葉一心時(shí)噴施藥劑，間隔24 h 噴施1 次，共噴施3 次，在第3 次噴施后12 h 人工接種病毒。設置無(wú)菌水處理為對照（Mock），每個(gè)處理10 株西瓜幼苗，重復3 次。接種病毒后第8天開(kāi)始觀(guān)察癥狀，記錄植株的顯癥率以及發(fā)病情況。

1.3 接種病毒

為保證接種效率，采用農桿菌介導侵染性克隆接種：將含有pXT1-ZYMV 質(zhì)粒的農桿菌GV3101接種于LB 液體培養基（含有50 μg · mL-1卡那霉素、50 μg · mL-1利福平）中，28 ℃，220 r · min-1培養24 h 以上，菌體經(jīng)離心收集后，用相同體積的誘導緩沖液（含有10 mmol · L-1MgCl2、10 mmol ·L-1MES 和100 μmol · L-1乙酰丁香酮）重懸，室溫靜置誘導2～12 h，用1 mL 注射器將誘導后的農桿菌注射接種于西瓜幼苗的子葉背面，待子葉葉片全部接滿(mǎn)即可（每株約接種0.4 mL）。

1.4 病情調查與統計

接種后第8 天開(kāi)始統計各處理植株的顯癥率，待對照植株的顯癥率達到100%時(shí)，調查各處理植株的病情級別，根據植株生長(cháng)狀態(tài)，調查心葉或心葉下方第1 片真葉。記錄植株顯癥率，并計算病情指數及相對防治效果。接種后15 d 調查顯癥率。

根據癥狀表現并參考古勤生（2001）的方法，將病情劃分為0～5 級：0 級，無(wú)癥狀；
1 級，只表現褪綠斑或明脈；
2 級，輕度花葉，無(wú)蕨葉；
3 級，嚴重花葉，無(wú)蕨葉；
4 級，嚴重花葉，輕微蕨葉；
5 級，嚴重花葉和蕨葉，葉片畸形嚴重（圖1）。

圖1 西瓜ZYMV 病情分級標準

顯癥率 = 顯癥株數/調查總株數 × 100%

病情指數 = ∑（某病級株數 × 病情級數）/（調查總株數 × 最高級數） × 100

相對防治效果 = （對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數 × 100%

1.5 數據處理

試驗數據取3 次重復的平均值，用Microsoft Excel 進(jìn)行統計處理。在P＜ 0.05 水平上，用SPSS 軟件以單因素ANOVA 分析鄧肯氏新復極差法對病情指數進(jìn)行方差分析。

2.1 確定誘抗劑最適濃度

供試6 種藥劑分別采用2 個(gè)濃度噴施西瓜幼苗（表1），在對照（Mock）的顯癥率達到100.00%時(shí)（第11 天），統計處理組的發(fā)病情況。結果顯示，除0.5 mmol · L-1BTH 和1 mmol · L-1Pip 外，其余藥劑處理植株顯癥率均低于100%，且與對照植株都存在顯著(zhù)差異；
其中0.5 mmol · L-1NHP和2 mmol · L-1Pip 處理后植株顯癥率和病情指數均明顯低于對照，且0.5 mmol · L-1NHP 的相對防效最高，達到73.33%。根據植株的顯癥率和相對防效，篩選出各藥劑的最大適宜濃度，且按防效高低依次為：NHP（0.5 mmol · L-1）、Pip（2 mmol · L-1）、殼寡糖（1 g · L-1）、沒(méi)食子酸（0.5 g · L-1）、BABA（1 mmol · L-1）、BTH（0.1 mmol · L-1）。

2.2 復配藥劑對病毒的防治效果

2.2.1 2 種藥劑復配對病毒的防治效果 根據單一組分藥劑對病毒的防治效果，將篩選出的藥劑濃度兩兩混合，共設置11 個(gè)藥劑組合進(jìn)行防效試驗，結果顯示（表2）：不同誘抗劑組合都對ZYMV 有一定的抑制作用，各處理病情發(fā)展速度均較對照慢。在對照組顯癥率達到100.00%時(shí)，有5 個(gè)藥劑組合處理的植株顯癥率低于50%，組合2-Ⅶ的顯癥率最低，僅為10.00%，其次為2-Ⅰ、2-Ⅴ、2-Ⅸ和2-Ⅺ，顯癥率分別為40.00%、30.00%、33.33%和25.00%；
各藥劑組合的病情指數均明顯低于對照，其中2-Ⅶ、2-Ⅴ病情指數明顯低于其他處理，兩處理相對防效分別為89.99%、75.72%，其次為2-Ⅸ，相對防效為73.34%。在病毒接種15 d 后，組合2-Ⅸ的顯癥率最低，仍有20.00%的植株沒(méi)有明顯癥狀（圖2）。結合顯癥率增加速度和相對防效，2-Ⅶ的防治效果優(yōu)于2-Ⅸ。雖然組合2-Ⅶ處理過(guò)的植株顯癥率增長(cháng)明顯較對照組緩慢，但是該組合處理后的植株相對于對照植株生長(cháng)明顯矮小，并且生長(cháng)速度相對緩慢（圖3）。

表2 2 種藥劑復配組合對西瓜ZYMV 的防治效果

圖3 噴施誘抗劑組合2-Ⅶ后植株的生長(cháng)狀態(tài)

2.2.2 3 種藥劑復配對病毒的防治效果 根據單一藥劑和2 種藥劑復配的試驗結果，進(jìn)一步設置了3 種藥劑的復配組合進(jìn)行防效試驗（表3）。結果顯示（圖4），接種后11 d 時(shí)，無(wú)菌水對照組植株顯癥率達到100.00%，而3-Ⅰ、3-Ⅱ和3-Ⅲ組合的植株顯癥率低于50%，分別為27.27%、33.33%和47.06%；
供試7 個(gè)復配組合的相對防效均在40%以上，3-Ⅰ、3-Ⅱ、3-Ⅳ、3-Ⅵ組合病情指數明顯低于其他組合，且3-Ⅰ、3-Ⅱ組合的相對防效分別為79.49%、68.27%，顯著(zhù)高于其他組合。其中3-Ⅱ組合顯癥率增長(cháng)最慢，并且比對照病癥輕、長(cháng)勢更好（圖5），到接種后17 d 時(shí)仍有25.00%的植株沒(méi)有明顯癥狀。綜合顯癥率和相對防效，組合3-Ⅱ防治效果最好，顯癥率低且效果持久。

表3 3 種藥劑復配組合對西瓜ZYMV 的防治效果

圖4 3 種誘抗劑復配組合后植株的顯癥率

圖5 噴施處理3-Ⅱ和無(wú)菌水后10 d 植株及葉片表型

試驗中發(fā)現噴施3-Ⅱ、3-Ⅲ和3-Ⅵ組合后，12～24 h 內植株會(huì )出現輕微過(guò)敏性壞死斑（圖6），其中3-Ⅱ組合出現過(guò)敏性壞死反應的植株比例最高，為63.7%，3-Ⅲ為35.2%，3-Ⅵ為11.1%，表明復配后的藥劑可能會(huì )誘導植株產(chǎn)生過(guò)敏性壞死反應從而增強植株的抗性。

圖6 噴施處理3-Ⅱ后24 h 植株產(chǎn)生過(guò)敏性壞死反應

本試驗中，噴施藥劑組合2-Ⅶ后植株長(cháng)勢相比對照明顯變緩。Kim 等（2009）研究指出，免疫系統過(guò)度激活會(huì )對植物產(chǎn)生不利影響，因此推測噴施2-Ⅶ組合的植株生長(cháng)遲緩可能與過(guò)度免疫反應有關(guān)。因此，雖然誘抗劑的使用明顯降低了植株的顯癥率，但是上述誘抗劑的施用濃度、噴施間隔時(shí)間仍需調整優(yōu)化，以平衡植株抗病與生長(cháng)之間的關(guān)系。

Pip 及其衍生物NHP 是植物響應病原體產(chǎn)生系統獲得性抗性（SAR）的重要信號化合物。Návarová 等（2012）在研究擬南芥系統獲得性抗性（SAR）時(shí)發(fā)現，丁香假單胞菌誘導的SAR 植株中能夠檢測到高濃度的Pip，而未接種葉片中則幾乎檢測不到。此外，Pip 還能夠誘導黃瓜增強對枯萎病菌的防御反應，并加速上調SAR 相關(guān)基因的轉錄（Pazarlar et al.，2021）。除Pip 外，NHP 也是SAR 的關(guān)鍵調節劑，可以從病原體侵染部位移動(dòng)至整個(gè)植株，并顯著(zhù)累積，激活SAR 抗病系統（Schnake et al.，2020）。NHP 能夠誘導植物免疫基因的表達以增強防御能力，放大防御反應，并且可以與防御激素水楊酸協(xié)同作用，促進(jìn)細胞過(guò)敏性壞死反應，為植物在未來(lái)病原體攻擊的情況下有效地激活免疫系統做好準備（Hartmann & Zeier，2018）。本研究中，Pip 及NHP 對西瓜ZYMV 具有較好的預防效果，可能與二者啟動(dòng)植株防御系統作用相關(guān)。

沒(méi)食子酸也在西瓜ZYMV 預防中展現出一定的作用。沒(méi)食子酸是一種多酚類(lèi)化合物，已被證明具有抗菌（Kang et al.，2018）、抗病毒（Mayela et al.，2016；
You et al.，2018）、 抗 腫 瘤（Ho et al.，2010）、 抗 炎（Bai et al.，2021；
Toyama et al.，2022）、抗氧化（Owumi et al.，2020；
Nouri et al.，2021）等多種生物活性。前期研究發(fā)現，沒(méi)食子酸能夠誘導煙草植株的病程相關(guān)蛋白PRs 的表達（李紅霞，2010），并且沒(méi)食子酸的衍生物被證明能誘導植株產(chǎn)生抗病信號（李黔柱，2009），增強植物的系統抗病性。本研究結果也表明沒(méi)食子酸在西瓜ZYMV 的防治中具有潛在作用。

在本研究3 種藥劑復配的組合中，3-Ⅱ、3-Ⅲ和3-Ⅵ均不同程度地表現出HR 反應，且這3 個(gè)組合均包含沒(méi)食子酸和Pip，進(jìn)一步表明這兩種誘抗劑可誘導西瓜植株產(chǎn)生抗病反應。

除了Pip、NHP 和沒(méi)食子酸之外，BTH、殼寡糖和BABA 等其他誘抗劑在煙草花葉病毒（TMV）防治中也表現出良好的效果（趙淑請和郭劍波，2003；
商文靜，2006；
周程愛(ài) 等，2007）。然而，在本研究中BTH、殼寡糖和ABA 對于西瓜ZYMV的防效作用并不明顯，可能是因為不同植物激活免疫系統的機制存在差異，并且處理時(shí)期、處理方法或處理濃度等因素也可能導致效果差異。因此，需要進(jìn)一步的試驗來(lái)完善和優(yōu)化這些誘抗劑的使用，并深入研究其誘導植物抗病性的分子機理。

綜上所述，在瓜類(lèi)病毒病害的綠色防控中，Pip、NHP 和沒(méi)食子酸等誘抗劑具有潛在的應用價(jià)值。后續研究可以結合植物內部抗性基因和生理生化指標的變化，優(yōu)化藥劑復配比例、施用方法和施用部位，以實(shí)現最佳的誘導抗病效果，并為瓜類(lèi)病毒病害的有效防治提供方法和策略。