大花紅景天總酚提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

孫羽珂 謝葉林 唐小慧 趙文吉 何正軍 賈國夫 黎 劍 陳宇航

1.成都醫學(xué)院藥學(xué)院，四川成都 610500；
2.四川省草原科學(xué)研究院青藏高原高寒草地生態(tài)修復工程技術(shù)研究中心，四川成都 611731；
3.四川省農業(yè)科學(xué)院農產(chǎn)品加工研究所，四川成都 610066

大花紅景天[Rhodiola crenulata（HooK.f.et.Thoms）H.Ohba] 為景天科紅景天屬多年生草本或灌木植物，以其干燥根和根莖入藥，為《中華人民共和國藥典》[1]（2020 版）紅景天藥材的基原植物，主產(chǎn)于西藏、四川等地。主要成分有黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、酚類(lèi)、有機酸類(lèi)等[2]，大花紅景天在抗腫瘤、保護心血管系統、抗疲勞、抗氧化、保肝[3-4]等方面具有藥理活性。大花紅景天富含總酚類(lèi)成分，在抗感染、抗癌和保護心腦血管[5-8]等方面效果明顯；
其還可通過(guò)調節抗氧化系統、能量代謝系統、中樞系統[7-9]等多方面發(fā)揮抗疲勞作用。

近年來(lái)，大花紅景天需求量日益增加，因其生長(cháng)在海拔高度2 300～5 000 m 的地區，環(huán)境較為惡劣，導致野生資源量正在急劇減少，部分地區瀕臨滅絕[10]；
同時(shí)人工栽培面積較少，栽培技術(shù)不完善，缺乏對適宜采收期的確定，進(jìn)一步加劇大花紅景天資源的匱乏。故本研究利用響應面法優(yōu)化大花紅景天總酚提取的工藝條件，構建超聲波輔助提取大花紅景天總酚的最優(yōu)工藝，使優(yōu)化后的提取工藝具備經(jīng)濟、工藝穩定和提取率高等優(yōu)勢。在此基礎上，通過(guò)分析野生與栽培大花紅景天藥材總酚含量與體外抗氧化活性及其相關(guān)性，為栽培大花紅景天采收期確定提供科學(xué)依據。

1.1 藥材

大花紅景天，野生及栽培樣品來(lái)源見(jiàn)表1，樣品去除泥土等雜質(zhì)，60℃烘干至恒重，打粉備用，供試樣品經(jīng)四川省草原科學(xué)研究院賈國夫研究員鑒定為景天科大花紅景天[Rhodiola crenulata（HooK.f.et.Thoms）H.Ohba]根及根莖。見(jiàn)表1。

表1 樣品來(lái)源

1.2 儀器和試劑

KH2200DB 型數控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng )超聲儀有限公司）；
FA1204 萬(wàn)分之一電子天平（上海皓莊儀器有限公司）；
A590 型紫外分光光度計（翱藝儀器有限公司）；
GF02100g 多功能粉碎機（上海霸輝工具有限公司）。

沒(méi)食子酸標準品（純度＞98%，批號：M01711812016，成都瑞芬思生物科技有限公司）；
福林酚（北京索萊寶科技有限公司，批號：NO.921O039）；
2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（上海麥克林生化科技股份有限公司，批號：C11629788）；
2，2-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（上海麥克林生化科技股份有限公司，批號：C11899818）。水為超純水，其余試劑均為分析純。

2.1 標準曲線(xiàn)制作

精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸對照品5.15 mg，加蒸餾水得濃度為0.103 mg/ml 對照品溶液。精密吸取沒(méi)食子酸對照品溶液0.0、0.1、0.3、0.5、0.6、0.8 ml 于10 ml 容量瓶中，加福林酚試劑0.5 ml 及20%碳酸鈉溶液1.7 ml，加蒸餾水定容。避光放置30 min，在760 nm 波長(cháng)處測定吸光度，回歸方程Y=10.605X+0.0733，r＝0.9995，Y 為吸光度，X 為對照品濃度，線(xiàn)性范圍0.00～0.08 mg/ml。

2.2 供試品溶液制備及測定

精密稱(chēng)取大花紅景天藥材粉末（HY2）0.1 g，加入一定量乙醇溶液在設定條件下進(jìn)行超聲輔助提取。精密移取100 μl 樣品提取液于10 ml 容量瓶中，按照“1.2.1”的方法測定提取液吸光度：

2.3 響應面優(yōu)化試驗

2.3.1 響應面試驗設計及結果 根據單因素預試驗結果，選用乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度為變量因素，進(jìn)行三因素三水平試驗設計，見(jiàn)表2。前期試驗證實(shí)料液比固定選用0.1∶8.0 g/ml，以總酚含量為響應值，其中乙醇濃度選用50%為佳、提取時(shí)間選用40 min 為佳、提取溫度選用50℃為佳。具體試驗結果見(jiàn)表3。

表2 試驗設計因素和水平

表3 響應面分析設計及結果

2.3.2 響應面方差分析及結果 對數據進(jìn)行二次多元回歸擬合，建立二次多元回歸方程：Y=12.16+0.46A+0.24B+0.23C-0.8AB+0.074AC+0.74BC-0.75A2-1.64B2-1.31C2。R2=0.982 8，調整后的R2=0.960 7，預測的R2=0.768 0，變異系數為2.65，精確度為18.391。三種水平因素對大花紅景天總酚含量提取率影響程度排序為：乙醇濃度＞提取時(shí)間＞提取溫度。一次項A，二次項A2、B2、C2，交互項AB、BC 對總酚含量提取率達到顯著(zhù)水平（P＜0.01）。見(jiàn)表4。響應面AB、BC 交互面坡度陡、等高線(xiàn)密集，提示這兩種因素對響應值的影響顯著(zhù)，見(jiàn)圖1。

圖1 各因素交互作用對總酚含量的影響

表4 響應面回歸模型方差分析及結果

2.3.3 驗證實(shí)驗 通過(guò)Design Expert 8.0.6 軟件預測最佳提取工藝為：乙醇濃度為53%、提取時(shí)間為40 min、提取溫度為51℃，預測總酚提取率為12.24 mg/g。結合實(shí)際修正條件：乙醇濃度為50%、提取時(shí)間為40min、提取溫度為50℃。利用此條件進(jìn)行3 次提取試驗，總酚提取率為（12.22±0.05）mg/g。

2.4 抗氧化活性研究

2.4.1 總酚含量測定 以?xún)?yōu)化后的最佳提取工藝得到大花紅景天提取液，計算總酚含量，栽培2 年生大花紅景天藥材7—9 月進(jìn)行總酚含量測定，9 月20 日達到最高值，為7.36 mg/g。野生藥材總酚含量均顯著(zhù)高于人工栽培2 年生藥材，以采自小金縣野生樣品（HY2）總酚含量最高，為14.68 mg/g，見(jiàn)表5。

表5 不同采收期大花紅景天總酚含量及抗氧化活性研究（n=3）

表6 不同來(lái)源大花紅景天提取液總酚含量及體外抗氧化能力比較

2.4.2 自由基清除率測定 取4 ml DPPH·溶液，加入1 ml無(wú)水乙醇，于517 nm 處測定吸光度A0。取1 ml 不同濃度提取液于4 ml 的DPPH·溶液中，搖勻后室溫避光放置30 min，在517 nm 處測定吸光度A1。用無(wú)水乙醇替換DPPH·溶液，測定其吸光度為A2。

取3 ml ABTS+·溶液，加入1 ml 蒸餾水，于734 nm波長(cháng)處測定吸光度A0。取1 ml 大花紅景天不同濃度提取液于3 ml ABTS+·溶液，搖勻后室溫靜置10 min。在734 nm 處測定吸光度A1。用蒸餾水替換ABTS 溶液，測定其吸光度為A2。

將清除率（%）導入GraphPad Prism 8 統計軟件中，以半數抑制濃度（median inhibitory concentration，IC50）值（mg/ml）表示清除能力，該值越小，抗氧化劑清除能力越強[11-12]。

野生樣品抗氧化活性強于人工栽培2 年生樣品，大花紅景天提取液清除DPPH·能力強于清除ABTS+·。見(jiàn)表5～6。

2.4.3 相關(guān)性分析

通過(guò)軟件IBM SPSS Statistics 26.0 處理數據可知，總酚含量與IC50值呈顯著(zhù)負相關(guān)。見(jiàn)表7。

表7 總酚含量與體外抗氧化活性的相關(guān)性分析（r 值）

總酚提取含量受乙醇濃度、時(shí)間、溫度等因素影響[13-15]。本研究通過(guò)響應面試驗，得到最優(yōu)提取條件：乙醇濃度為50%、提取時(shí)間為40 min、提取溫度為50℃，大花紅景天總酚提取率為12.22 mg/g。紅景天活性成分含量與其生長(cháng)的土壤、施肥量、光照、氣溫等環(huán)境條件有關(guān)[16]。本研究結果顯示，栽培2 年生大花紅景天9 月20 日其總酚含量達到最大值；
同時(shí)，有研究表明，秋季采挖紅景天總酚含量高[17]，人工馴化樣品10 月最高[18-19]，因此，大花紅景天適宜采收期為9 月下旬至10 月下旬地上部分枯萎后。

野生大花紅景天總酚含量均顯著(zhù)高于人工栽培品，可能原因是生長(cháng)年限將影響有效物質(zhì)積累[20]；
栽培樣品僅為2 年生，而野生為多年生，同時(shí)栽培樣品的生長(cháng)環(huán)境與野生環(huán)境不一致，酚類(lèi)物質(zhì)為主要次生代謝產(chǎn)物，其植物應對逆境脅迫過(guò)程起到保護和調節作用，有利于群落延續[21-22]。

本研究顯示，大花紅景天總酚具有較強體外抗氧化活性，野生樣品總酚含量和抗氧化活性均優(yōu)于人工栽培樣品，大花紅景天總酚含量隨不同采收期而變化，其不同采收期總酚類(lèi)物質(zhì)含量變化趨勢與不同采收期清除自由基能力變化趨勢一致[23]?？偡雍颗c抗氧化活性具有顯著(zhù)的正相關(guān)性[24-25]，本研究結果為大花紅景天栽培和資源開(kāi)發(fā)利用提供參考。