lncRNA,GAS5調控Notch通路對炎癥環(huán)境下牙髓干細胞成骨分化的影響

何龍 云蔓 吳薇薇 翁海勇 王瓊超

牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)具有與骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)相似的免疫表型和多能分化特征[1]。據報道，炎性DPSCs的成骨能力低于正常DPSCs[2]，但對其機制的了解仍然有限。明確炎癥環(huán)境下DPSCs的成骨分化受到抑制的分子機制，對尋找有效的牙齒再生的藥物至關(guān)重要。長(cháng)鏈非編碼RNA生長(cháng)阻滯特異性轉錄本5(long non-coding RNA growth arrest-specific transcript 5,lncRNA GAS5)在多種癌癥中受到抑制[3]。研究發(fā)現lncRNA GAS5的過(guò)表達通過(guò)調節microRNA-498上調RUNX2的表達來(lái)促進(jìn)hMSCs的成骨分化[4]；
可促進(jìn)人牙周膜干細胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)的成骨分化。在成人牙齒齲壞或受傷的牙髓區域的間充質(zhì)細胞中，Notch信號被上調[5]。Notch通路的激活可以抑制DPSCs的成牙本質(zhì)細胞分化，并抑制間充質(zhì)祖細胞的成骨細胞分化[6]。而lncRNA GAS5是與Notch信號相互作用的lncRNA之一[7]，GAS5的敲低與Notch通路的激活和細胞炎性損傷有關(guān)[8]。推測lncRNA GAS5可能調控Notch通路影響人牙髓干細胞(hDPSCs)成骨分化。本研究采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)溶液和過(guò)表達lncRNA GAS5的慢病毒載體同時(shí)處理hDPSCs，探討其對成骨分化的影響，并初步探討其機制。

1.1 實(shí)驗材料

hDPSCs(BFN60810649，上海青旗生物技術(shù)發(fā)展有限公司)；
胎牛血清、DMEM培養基、胰蛋白酶(Gbico公司，美國)；
LPS(L5293)(Sigma-Aldrich,美國)；
RIPA裂解液(P0013B)(上海碧云天生物科技公司)；
Trizol試劑(9108-1)；
過(guò)表達lncRNA GAS5的慢病毒載體及其對照空載體(上海Gene Pharma公司)；
Jagged-1(Notch通路的激動(dòng)劑，HY-P1846A)(MedChemExpress公司，美國)；
骨鈣素(osteocalcin，OCN)(ab93876)、Hey1(hairy and enhancer of split-related with YRPW motif 1)(ab154077)、發(fā)狀分裂相關(guān)增強子1(hairy and enhancer of split 1,Hes1)(ab108937)、GAPDH(ab9485)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)(Abcam公司,英國)。細胞培養箱、NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司,美國)；
ABI Prism?7300型熒光定量PCR系統(ABI公司，美國)；
IX73倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)；
iMark680多功能酶標儀、蛋白轉膜裝置、凝膠成像系統(Bio-Rad公司，美國)。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 細胞培養 hDPSCs在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養基中，于37 ℃、5%CO2的濕潤培養箱中培養和傳代。每3 d補充新鮮培養基，待細胞達到80%融合時(shí)進(jìn)行傳代。取第3代細胞用于后續實(shí)驗。

1.2.2 細胞分組與處理 將hDPSCs(第3代)以每孔1×105個(gè)細胞的密度接種在6 孔板中，分為(1):正常對照組：細胞在含有10%胎牛血清的培養基中正常培養；
(2)成骨誘導組：用成骨誘導培養基(含有10%胎牛血清、100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸、50 mg/mL抗壞血酸)培養hDPSCs；
(3)LPS組：用含10 μg/mL LPS的成骨誘導培養基培養hDPSCs；
(4)NC+LPS組：慢病毒對照空載體感染hDPSCs 72 h，然后用含10 μg/mL LPS的成骨誘導培養基培養hDPSCs；
(5)GAS5過(guò)表達組：含有過(guò)表達lncRNA GAS5的慢病毒載體感染hDPSCs 72 h，然后用含10 μg/mL LPS的成骨誘導培養基培養hDPSCs；
(6)Jagged-1組：用含10 μg/mL LPS和10 μmol/L Jagged-1的成骨誘導培養基培養hDPSCs；
(7)GAS5過(guò)表達+Jagged-1組：在過(guò)表達lncRNA GAS5的慢病毒載體感染hDPSCs 72 h后，用含10 μg/mL LPS和10 μmol/L Jagged-1的成骨誘導培養基培養hDPSCs。每隔3 d更換新鮮培養基。倒置顯微鏡下觀(guān)察hDPSCs形態(tài)變化。

1.2.3 CCK-8檢測細胞增殖活性 將hDPSCs以每孔2×103個(gè)細胞接種在96 孔培養板中，在誘導分化的第1、3和7天用CCK-8檢測細胞增殖活性。加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃避光孵育細胞2 h。使用多功能酶標儀在490 nm波長(cháng)處測量各孔的光密度(A)值，以表示細胞增殖活性。

1.2.4 RT-qPCR檢測細胞中lncRNA GAS5的表達量變化 取誘導分化14 d的hDPSCs，使用Trizol試劑分離總RNA。NanaDrop分光光度計檢測總RNA的濃度和純度；
RNA反轉錄為cDNA，使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。反應體系(25 μL)：SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)12 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA(200 ng/μL) 1 μL，ddH2O 11 μL。反應條件：94 ℃預變性10 min；
95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，75 ℃延伸20 s，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。用GAPDH作為內參對照，采用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達量。lncRNA GAS5正向引物：5′-GTGTGGCTCTGGATAGCAC-3′和反向引物：5′-ACCCAAGCAAGTCATCCATG-3′；
GAPDH正向引物：5′-ACAGGGGAGGTGATAGCATT-3′和反向引物：5′-GACCAAAAGCCTTCATACATCTC-3′。

1.2.5 ELISA檢測細胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β水平 收集誘導分化14 d的hDPSCs細胞培養上清液，按照ELISA試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作檢測上清液中TNF-α、IL-1β的水平。

1.2.6 比色法檢測hDPSCs中ALP活性 在誘導分化第7天，棄去培養液，使用0.1% TritonX-100裂解細胞，12 000 g離心10 min，取上清液，使用ALP活性檢測試劑盒測定上清液中ALP活性。

1.2.7 茜素紅染色檢測hDPSCs中鈣離子沉積情況

hDPSCs培養14 d，用4%多聚甲醛固定后，加入200 μL茜素紅S染液。顯微鏡下觀(guān)察鈣化結節情況，拍照后使用Image-Pro Plus 6.0軟件統計鈣化結節染色陽(yáng)性區域的面積及鈣化結節的數量。

1.2.8 Western blot檢測hDPSCs中Notch通路和成骨相關(guān)蛋白的表達 BCA蛋白測定法測定蛋白質(zhì)濃度。在室溫下用5%脫脂奶粉(溶于TBST，TBS加0.1%Tween-20)封閉1 h后，在4 ℃下用一抗(NICD、Hes1、Hey1、RUNX2、OCN，1∶1 000；
GAPDH，1∶5 000)孵育過(guò)夜。隨后，將膜與HRP標記的山羊抗兔IgG(H+L，1∶10 000)在室溫下孵育1 h。然后使用ECL顯色，使用Image-Pro Plus 6.0軟件量化條帶灰度值并以GAPDH為內參對照進(jìn)行標準化。

1.3 統計學(xué)分析

2.1 hDPSCs細胞形態(tài)

體外培養hDPSCs結果顯示，原代細胞培養5～7 d，hDPSCs表現出典型的間充質(zhì)細胞特點(diǎn)，可見(jiàn)細胞貼壁生長(cháng)，細胞呈長(cháng)梭形，成纖維細胞樣生長(cháng)(圖 1A)；
原代細胞傳代培養(正常對照組)，細胞貼壁生長(cháng)呈旋渦狀(圖 1B)；
用成骨誘導培養基誘導成骨分化后，hDPSCs仍具有成纖維細胞樣的梭形形態(tài)，但是較正常對照組培養基中的細胞更大，在鈣化沉淀區域有細胞簇形成(圖 1C)；
經(jīng)LPS處理后，細胞密度降低，稀疏，細胞間隙增大，細胞未見(jiàn)明顯伸展(圖 1D)；
NC+LPS組細胞形態(tài)和LPS組相似(圖 1E)；
GAS5過(guò)表達組細胞排列緊密，多為長(cháng)梭形，呈漩渦樣生長(cháng)，有細胞簇形成(圖 1F)；
Jagged-1組細胞體積較小，細胞密集度不高，細胞多呈圓形，長(cháng)梭形細胞較少(圖 1G)；
GAS5過(guò)表達+Jagged-1組細胞體積有所增大，排列較為密集，長(cháng)梭形細胞較Jagged-1組增多(圖 1H)。

2.2 各組細胞增殖能力比較

圖 1 hDPSCs細胞形態(tài)(相差顯微鏡， ×400)

在誘導分化的第3和7天，與正常對照組相比，成骨誘導組細胞的增殖活性升高(P<0.05)，而LPS組細胞的增殖活性降低(P<0.05)；
與LPS組相比，GAS5過(guò)表達組細胞的增殖活性升高(P<0.05)，Jagged-1組細胞的增殖活性降低(P<0.05)；
與GAS5過(guò)表達組相比，GAS5過(guò)表達+Jagged-1組細胞增殖活性降低(P<0.05)；
與Jagged-1組相比，GAS5過(guò)表達+Jagged-1組細胞增殖活性升高(P<0.05)(表 1)。

表 1 各組細胞增殖能力比較

Tab 1 Comparison of cell proliferation among the groups

表 1 各組細胞增殖能力比較

組 別1 d3 d7 d正常對照組0.24±0.030.50±0.060.71±0.08成骨誘導組0.25±0.050.63±0.07①0.82±0.11①LPS組0.22±0.040.38±0.05①0.41±0.06①NC+LPS組0.21±0.030.36±0.040.43±0.07GAS5過(guò)表達組0.27±0.050.72±0.08②0.95±0.10②Jagged-1組0.20±0.040.25±0.04②0.30±0.05②GAS5過(guò)表達+Jagged-1組0.23±0.040.49±0.06③④0.64±0.08③④

注：
與正常對照組相比， ①P<0.05；

與LPS組相比， ②P<0.05；

與GAS5過(guò)表達組相比， ③P<0.05；

與Jagged-1組相比， ④P<0.05

2.3 各組細胞中lncRNA GAS5的表達量變化

與正常對照組相比，成骨誘導組細胞中lncRNA GAS5水平升高(P<0.05)，而LPS組細胞中lncRNA GAS5水平降低(P<0.05)；
與LPS組相比，GAS5過(guò)表達組細胞中lncRNA GAS5水平升高(P<0.05)；
與Jagged-1組相比，GAS5過(guò)表達+Jagged-1組細胞中lncRNA GAS5水平升高(P<0.05)(表 2)。

表 2 各組細胞中lncRNA GAS5的表達量變化

2.4 各組細胞上清液中TNF-α、IL-1β水平變化

與正常對照組相比，LPS組TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)；
與LPS組相比，GAS5過(guò)表達組TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05)，Jagged-1組TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)；
與GAS5過(guò)表達組相比，GAS5過(guò)表達+Jagged-1組TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)；
與Jagged-1組相比，GAS5過(guò)表達+Jagged-1組TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05)(表 3)。

2.5 各組細胞中ALP活性比較

與正常對照組相比，成骨誘導組ALP活性升高(P<0.05)，而LPS組ALP活性降低(P<0.05)；
與LPS組相比，GAS5過(guò)表達組ALP活性升高(P<0.05)，Jagged-1組ALP活性降低(P<0.05)；
與GAS5過(guò)表達組相比，GAS5過(guò)表達+Jagged-1組ALP活性降低(P<0.05)；
與Jagged-1組相比，GAS5過(guò)表達+Jagged-1組ALP活性升高(P<0.05)(表 4)。

表 3 各組細胞上清液中TNF-α、IL-1β水平

表 4 各組細胞中ALP活性

2.6 各組細胞的礦化能力比較

與正常對照組相比，成骨誘導組鈣化結節的數量和面積增加(P<0.05)，而LPS組鈣化結節的數量和面積降低(P<0.05)；
與LPS組相比，GAS5過(guò)表達組鈣化結節的數量和面積升高(P<0.05)，Jagged-1組鈣化結節的數量和面積降低(P<0.05)；
與GAS5過(guò)表達組相比，GAS5過(guò)表達+Jagged-1組鈣化結節的數量和面積降低(P<0.05)；
與Jagged-1組相比，GAS5過(guò)表達+Jagged-1組鈣化結節的數量和面積升高(P<0.05)(圖 2、表 5)。

圖 2 各組hDPSCs茜素紅染色(×200)

表 5 各組細胞中鈣化結節的數量和面積

2.7 各組細胞中Notch通路和成骨相關(guān)蛋白的表達

與正常對照組相比，成骨誘導組細胞中NICD、Hes1、Hey1蛋白表達降低，RUNX2、OCN蛋白表達升高(P<0.05)，LPS組細胞中NICD、Hes1、Hey1蛋白表達升高，RUNX2、OCN蛋白表達降低(P<0.05)；
與LPS組相比，GAS5過(guò)表達組細胞中NICD、Hes1、Hey1蛋白表達降低，RUNX2、OCN蛋白表達升高(P<0.05)，Jagged-1組NICD、Hes1、Hey1蛋白表達升高，RUNX2、OCN蛋白表達降低(P<0.05)；
與GAS5過(guò)表達組相比，GAS5過(guò)表達+Jagged-1組NICD、Hes1、Hey1蛋白表達升高，RUNX2、OCN蛋白表達降低(P<0.05)；
與Jagged-1組相比，GAS5過(guò)表達+Jagged-1組NICD、Hes1、Hey1蛋白表達降低，RUNX2、OCN蛋白表達升高(P<0.05)(表 6,圖 3)。

表 6 各組細胞中Notch通路和成骨相關(guān)蛋白的表達

圖 3 各組細胞中Notch通路和成骨相關(guān)蛋白的表達

炎癥環(huán)境不僅影響牙髓細胞的活力，還影響DPSCs的分化功能[9]。細菌主要成分LPS會(huì )誘導牙髓組織炎癥導致牙髓損傷，同時(shí)抑制hPDLSCs的成骨分化[10]。lncRNA GAS5在hDPSCs中的特異性激活促進(jìn)了成骨分化。這一發(fā)現提供了一種促進(jìn)hDPSCs成骨能力的有效方法。

本研究結果顯示，lncRNA GAS5在hDPSCs的成骨分化誘導過(guò)程中的表達增加；
而在LPS處理的炎癥條件下，hDPSCs的成骨分化被抑制時(shí)，其表達降低；
同時(shí)研究發(fā)現過(guò)表達lncRNA GAS5后，hDPSCs的增殖活性和成骨分化能力均較LPS組增加，提示：過(guò)表達lncRNA GAS5在炎癥環(huán)境中可促進(jìn)hDPSCs成骨分化。在本研究中，LPS可抑制hDPSCs的增殖和成骨分化，而另有文獻顯示LPS能夠促進(jìn)hDPSCs向成牙本質(zhì)細胞分化，并可通過(guò)增強hDPSCs進(jìn)入牙髓時(shí)的粘附和遷移來(lái)影響牙髓愈合[11]。這與本文研究結果不一致，經(jīng)查閱資料發(fā)現，LPS對hDPSCs的影響具有時(shí)間依賴(lài)性和濃度依賴(lài)性[12]，結果不一致的原因可能與LPS的濃度有關(guān)。Notch信號通路調節牙髓組織中的多種生物過(guò)程，并可調節成骨分化[13]。研究發(fā)現，過(guò)表達NICD可抑制RUNX2、OCN的表達從而抑制成骨分化[14]，表明Notch信號通路的激活與成骨分化的抑制有關(guān)。此外，Notch信號被視為針對感染和炎癥驅動(dòng)疾病的潛在治療靶點(diǎn)[15]，據報道，在LPS刺激或機械損傷后的牙髓細胞中發(fā)現了Notch信號的體外和體內激活[16]。本研究結果顯示，經(jīng)LPS處理的hDPSCs中，TNF-α、IL-1β水平和NICD、Hes1、Hey1表達均升高，且使用Jagged-1后上述指標進(jìn)一步升高，說(shuō)明在炎癥環(huán)境下hDPSCs成骨分化受到抑制的過(guò)程中Notch信號通路被激活。Manokawinchoke等[17]的研究顯示Jagged-1可激活人牙周膜基質(zhì)細胞中的Notch信號通路，以劑量依賴(lài)性方式增強Hes1和Hey1 mRNA的表達，與本研究結果一致。然而，另有研究顯示，Notch信號通路的激活對人牙髓和牙周膜細胞成骨分化和骨礦化具有促進(jìn)作用[18]，可能為Notch信號參與成骨分化的作用因細胞類(lèi)型和分化階段而異。

同時(shí)本研究發(fā)現，在lncRNA GAS5過(guò)表達組中NICD、Hes1和Hey1的表達較LPS組降低，而RUNX2和OCN的表達較LPS組升高，說(shuō)明過(guò)表達lncRNA GAS5可抑制Notch信號通路的激活，促進(jìn)hDPSCs成骨分化；
此外，Jagged-1可明顯減弱lncRNA GAS5過(guò)表達對Notch信號通路的抑制作用和hDPSCs成骨分化的促進(jìn)作用，進(jìn)一步提示過(guò)表達lncRNA GAS5可能通過(guò)抑制Notch信號通路激活，增強炎癥環(huán)境下hDPSCs成骨分化。這與Li等[8]的研究一致，lncRNA GAS5可能通過(guò)抑制Notch信號通路改善LPS誘導的軟骨細胞炎癥損傷。

綜上所述，lncRNA GAS5在hDPSCs成骨分化中上調，過(guò)表達lncRNA GAS5可增強炎癥環(huán)境下hDPSCs成骨分化能力，其作用機制可能與抑制Notch信號通路的激活有關(guān)。但由于體內外環(huán)境存在較大差異，本研究結果尚需體內實(shí)驗進(jìn)一步驗證。