沈芳銘，尹淑濤，趙沖
中國農業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養工程學(xué)院， 北京 100083
紫外線(xiàn)是影響皮膚健康的關(guān)鍵環(huán)境因素之一。長(cháng)期的紫外線(xiàn)暴露不僅可能引起紅斑、色素沉著(zhù)、免疫抑制等急性損傷，還可能誘發(fā)光老化、皮膚癌等慢性損傷[1-2]。能夠穿越臭氧層到達地球表面的紫外線(xiàn)包括320～400 nm的長(cháng)波紫外線(xiàn)(UVA)和280～320 nm的中波紫外線(xiàn)(UVB)[2]。UVB是主要的生物效應誘發(fā)因子，具有比UVA更強的遺傳毒性和皮膚損傷能力[3]。UVB的光子能量可被皮膚表皮角質(zhì)形成細胞直接吸收，其通過(guò)誘導同一條鏈上相鄰堿基之間生成環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CPD)和6-4光產(chǎn)物(6-4PPs)而導致DNA損傷[4-5]。真核細胞可通過(guò)多種途徑修復受損DNA[6]，而紫外線(xiàn)誘導的光損傷產(chǎn)物主要通過(guò)核苷酸切除修復(NER)的途徑去除[7]。已有研究[8-12]表明，安石榴苷、白藜蘆醇、番茄紅素、單寧酸、蘆薈甾醇等天然活性成分能夠保護UVB誘導的皮膚損傷。其中安石榴苷是石榴果皮多酚中最主要的活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種生理活性[12]，將安石榴苷與納米二氧化鈦復配添加到化妝品基質(zhì)中可發(fā)揮優(yōu)良的防曬效果[13]；
在3D皮膚模型中，安石榴苷能降低酪氨酸酶活性、抑制黑色素生成，具有美白作用[14]；
安石榴苷預處理可抑制UVB照射所致的人正常皮膚永生化角質(zhì)形成細胞(HaCaT細胞)凋亡[15]。目前已有研究主要集中于安石榴苷對皮膚的直接作用效果，將其作為膳食活性成分攝入、經(jīng)腸道吸收后能否發(fā)揮對皮膚的保護作用尚鮮有報道。
UVB既能直接作用于DNA，也能通過(guò)產(chǎn)生活性氧(ROS)繼發(fā)性地對細胞核及線(xiàn)粒體DNA造成氧化損傷[16]。M.Zahin等[17]研究發(fā)現，安石榴苷能抑制苯并[a]芘誘導的DNA加和物的形成，具有較強的抗突變活性。SIRT1蛋白作為一種廣泛表達于哺乳動(dòng)物體內、高度保守的去乙?；?，參與DNA損傷修復，有利于維護基因組的穩定性[18]。課題組前期研究[19]發(fā)現，安石榴苷能增強HaCaT細胞中SIRT1基因啟動(dòng)子活性，激活NER途徑，去除UVB誘導產(chǎn)生的CPD?；诖?，本文擬建立人結直腸腺癌細胞(Caco-2細胞)與HaCaT細胞腸-皮膚共培養體系，進(jìn)一步研究安石榴苷經(jīng)腸道吸收轉運后對UVB誘導皮膚損傷的抑制效果及機制，為研發(fā)功效確切、機制明確的食品功能性成分用于防治UVB誘導的皮膚損傷提供理論依據與參考。
安石榴苷、多聚甲醛、Triton-X100、甲醇、Tris-HCl緩沖液(pH值為6.8)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、2-巰基乙醇(2-ME)，美國Sigma公司產(chǎn)；
Caco-2細胞、HaCaT細胞、293T細胞，日本理研生物資源中心產(chǎn)；
DMEM完全培養基，日本Nissui公司產(chǎn)；
胎牛血清、山羊血清，美國Life Technologies公司產(chǎn)；
帶細胞培養小室的24孔Transwell培養板(3470型)，美國Corning公司產(chǎn)；
慢病毒表達質(zhì)粒pSUPER.retro.puro、輔助質(zhì)粒pVSV-G、pGag-pol，美國OligoEngine公司產(chǎn)；
HilyMax試劑、Hoechst 33342溶液，日本Dojindo Molecular Technologies公司產(chǎn)；
聚凝胺、蛋白G磁珠，美國Merck Millipore公司產(chǎn)；
嘌呤毒素，美國Enzo Life Sciences公司產(chǎn)；
CPD抗體(#NMDND001)，日本Cosmo Bio 公司產(chǎn)；
Alexa Fluor 555標記的山羊抗小鼠IgG抗體(A-21422)，美國Life Technologies公司產(chǎn)；
高純度RNA分離試劑盒，日本Roche公司產(chǎn)；
ReverTra Ace qPCR RT試劑盒，日本Toyobo公司產(chǎn)；
KAPA SYBR Fast qPCR試劑盒，美國KAPA Biosystems公司產(chǎn)；
Acetylated-Lysine抗體(#9441)、辣根過(guò)氧化物酶標記的馬抗小鼠IgG抗體(#7076)，美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)；
XPA抗體(ab65963)，英國Abcam公司產(chǎn)。
311型細胞培養箱，美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)；
Millicell-ERS-2型細胞電阻儀，美國Millipore公司產(chǎn)；
CL-1000型紫外交聯(lián)儀，美國UVP公司產(chǎn)；
IN Cell Analyzer 1000活性細胞熒光顯微圖像獲取及分析系統，英國GE Healthcare公司產(chǎn)；
TP-800型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，日本Takara公司產(chǎn)；
LAS-1000 Lumino型圖像分析儀，日本Fujifilm公司產(chǎn)。
1.3.1 細胞培養Caco-2細胞及HaCaT細胞均采用含10%(如無(wú)特指，文中百分數均指體積分數)胎牛血清的DMEM完全培養基，于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養2～3 d，以適宜比例傳代，選取處于對數生長(cháng)期的細胞進(jìn)行后續實(shí)驗。
1.3.2 單層Caco-2細胞模型的構建和評價(jià)將Caco-2細胞以2×105CFU/mL、每孔250 μL接種于24孔Transwell培養板的細胞培養小室中，培養板下室加入750 μL DMEM完全培養基，根據培養液狀態(tài)適時(shí)更換培養基。另設不接種Caco-2細胞的空白對照組，在Transwell 培養板的上室和下室均加入相應體積的DMEM完全培養基。
通過(guò)細胞單層跨膜電阻(TEER)判斷Caco-2細胞是否形成緊密完整的腸上皮樣單層。單層Caco-2細胞兩側的電阻通過(guò)細胞電阻儀測定，根據下式計算TEER。
TEER=(Rsample-Rblank)×S
式中，Rsample為樣品組電阻/Ω，Rblank為空白對照組電阻/Ω，S為細胞培養小室有效膜面積(0.3 cm2)。
1.3.3shSIRT1-HaCaT細胞模型的構建參考文獻[19]的方法構建shSIRT1-HaCaT細胞模型。將含有SIRT1特異性序列的短發(fā)卡(Short Hairpin，sh)RNA(序列見(jiàn)表1)克隆至慢病毒表達質(zhì)粒pSUPER.retro.puro中。在HilyMax試劑作用下，將構建的表達載體pSUPER-puro-shSIRT1與pVSV-G、pGag-pol共同轉染293 T細胞以制備病毒上清液。將293 T細胞分別經(jīng)含10%和2%胎牛血清的DMEM培養基各培養24 h后，收集含有慢病毒顆粒的上清液。將HaCaT細胞用含10 μg/mL 聚凝胺的病毒上清液于37 ℃條件下感染24 h后，在HaCaT細胞中加入3 μg/mL嘌呤毒素，3 d后篩選得到穩定的shSIRT1-HaCaT細胞模型。
1.3.4UVB誘導HaCaT細胞損傷模型的構建及加藥處理課題組前期研究[19]發(fā)現，10 μmol/L的安石榴苷對正常HaCaT細胞活力無(wú)顯著(zhù)影響，且可逆轉UVB照射導致的細胞生長(cháng)抑制，因此，本文選取該濃度進(jìn)行實(shí)驗。單層Caco-2細胞模型構建完成后，將安石榴苷母液用DMEM完全培養基稀釋至10 μmol/L，替換Transwell培養板細胞培養小室中的原培養基，培養48 h后收集下室的培養液，儲存于-80 ℃冰箱中，備用。
將生長(cháng)狀況良好、處于對數生長(cháng)期的HaCaT細胞、shSIRT1-HaCaT細胞以適宜濃度接種于35 mm細胞培養皿中。培養24 h后，將各皿中的培養基吸出，添加少量PBS(1×,pH值為7.2～7.4)浸潤細胞，用紫外交聯(lián)儀模擬UVB照射，劑量為8 mJ/cm2，24 h后再次進(jìn)行UVB照射。為保證各組實(shí)驗操作的一致性，無(wú)需進(jìn)行紫外線(xiàn)照射的實(shí)驗組仍需模擬UVB照射過(guò)程，用錫箔紙覆蓋避光。2次UVB照射結束6 h后，棄去舊培養基，各皿中加入回收的單層Caco-2細胞模型中下室的培養液(需提前預熱)，繼續培養48 h后進(jìn)行后續實(shí)驗。
1.3.5 安石榴苷對UVB誘導HaCaT細胞產(chǎn)生CPD的抑制作用評價(jià)參考M.Udono等[20]的方法進(jìn)行免疫熒光測試。將HaCaT細胞接種于熒光黑色平板中，培養過(guò)夜。第2 d從培養箱中取出平板，吸除原培養基。4%多聚甲醛固定15 min后，用冰冷甲醇浸沒(méi)細胞，冰上孵育10 min，隨后用含5%山羊血清和0.3%Triton-X100的封閉液室溫封閉1 h。吸除封閉液后，加入一抗(CPD抗體)4 ℃孵育過(guò)夜，而后加入二抗(Alexa Fluor 555標記的山羊抗小鼠IgG抗體)室溫孵育1 h。用Hoechst 33342溶液在室溫條件下避光孵育10 min，用IN Cell Analyzer 1000獲取細胞圖像，用Multi-Target Analysis Tool進(jìn)行成像數據分析，用Spotfire DecisionSite Client v.8.2進(jìn)行可視化處理。
1.3.6HaCaT細胞內XPC基因轉錄水平的測定參考文獻[19]的方法測定細胞著(zhù)色性干皮病基因組C(XPC)的mRNA轉錄水平。按照高純度RNA分離試劑盒說(shuō)明書(shū)上的步驟提取細胞RNA，利用ReverTra Ace qPCR RT 試劑盒逆轉錄合成cDNA，參照KAPA SYBR Fast qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應體系，隨后進(jìn)行聚合酶鏈式反應(PCR)。實(shí)驗重復3次，以β-actin作為內參基因。XPC和β-actin基因的PCR堿基序列見(jiàn)表1。
表1 引物序列Table 1 Primer sequences
1.3.7HaCaT細胞內XPA蛋白乙?；降臏y定參照1.3.4進(jìn)行實(shí)驗，隨后收集各組細胞，按照文獻[19]的方法進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗。用預冷的NP-40裂解緩沖液進(jìn)行細胞全蛋白提取，在提取的總蛋白中加入Acetylated-Lysine抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，形成免疫復合物。加入蛋白G磁珠捕獲抗體及其結合的蛋白，4 ℃孵育過(guò)夜。用樣品緩沖液(1 mol/L Tris-HCl(pH值為6.8),10%SDS,10%2-ME)洗脫免疫沉淀，采用蛋白免疫印跡法分析樣品。用質(zhì)量分數12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳100 min，隨后將蛋白質(zhì)轉移到Hybond-P蛋白雜交膜上，室溫條件下封閉2 h，加入XPA抗體于4 ℃條件下孵育過(guò)夜，而后加入二抗(辣根過(guò)氧化物酶標記的馬抗小鼠IgG抗體)在室溫條件下孵育1 h。用ImmunoStar LD化學(xué)發(fā)光法測定蛋白乙?；?，用圖像分析儀進(jìn)行可視化處理。
采用軟件SPSS 19.0處理實(shí)驗數據，結果以(平均值±標準差)表示，用T檢驗進(jìn)行顯著(zhù)性分析，P<0.05表示差異顯著(zhù)。利用軟件GraphPad Prism 8作圖。
Caco-2細胞在體外培養的條件下可自發(fā)分化形成緊密的單細胞層組織，具有小腸微絨毛結構和各種營(yíng)養物質(zhì)轉運載體，是理想的腸道吸收模型[21]。TEER可在一定程度上反映單層Caco-2細胞的緊密性與完整性[22]。本研究分別在Caco-2細胞接種后第3 d、第14 d進(jìn)行TEER的測定。當TEER達到約 800 Ω·cm2的穩定讀數時(shí)，即可認為Caco-2 細胞模型已完全分化[23]。單層Caco-2細胞的TEER測定結果如圖1所示，其中***表示組間差異極顯著(zhù)(P<0.001)，下同。由圖1可知，Transwell培養板上的Caco-2細胞培養至14 d時(shí)，TEER為(2350±140) Ω·cm2，表明細胞已形成完整的致密單層，模型建立成功，可進(jìn)行腸-皮膚共培養體系的構建。
圖1 單層Caco-2細胞模型的TEER測定結果Fig.1 TEER assay of monalayer Caco-2 cells
CPD和6-4PPs是UVB誘導產(chǎn)生的主要光損傷產(chǎn)物，其中CPD占比約70%～80%[24-25]，是哺乳動(dòng)物細胞中紫外線(xiàn)誘導突變的主要原因[26]。F.Afaq等[27]研究發(fā)現，在UVB照射前，用石榴汁或石榴提取物(均含有包括安石榴苷在內的多酚類(lèi)物質(zhì))分別在人體再造皮膚上進(jìn)行預處理，均可顯著(zhù)減少CPD陽(yáng)性細胞的數量，其作用機制與石榴衍生物的抗氧化活性和對DNA損傷修復的促進(jìn)作用相關(guān)。UVB照射后，安石榴苷對HaCaT細胞內CPD水平的影響如圖2所示。由圖2a)可知，UVB照射使對照組的CPD陽(yáng)性細胞(紅色)比例從24%增加到31%，說(shuō)明本研究所采取的UVB照射方式能夠誘導光損傷產(chǎn)物的形成。安石榴苷處理后，CPD陽(yáng)性細胞比例降低至22%。此外，在未經(jīng)UVB照射的條件下，安石榴苷處理也能使CPD陽(yáng)性細胞比例從24%降至15%。此結果與課題組前期在HaCaT細胞模型中的研究結論一致[19]，表明安石榴苷在腸-皮膚共培養體系中模擬腸道吸收后仍能修復UVB誘導的光損傷，且在非紫外線(xiàn)照射條件下，安石榴苷對DNA也具有一定的保護作用。
圖2 安石榴苷對HaCaT細胞內CPD水平的影響Fig.2 Effects of punicalagin on CPD level in HaCaT cells
為探究安石榴苷對CPD的抑制作用是否依賴(lài)于SIRT1蛋白的調控，本實(shí)驗對UVB照射條件下Mock(空白對照)和shSIRT1-HaCaT細胞中的CPD水平進(jìn)行了評價(jià)，結果見(jiàn)圖2b)。在Mock細胞中，安石榴苷使CPD陽(yáng)性細胞比例從22%降至7%，慢病毒轉導敲低SIRT1基因顯著(zhù)消除了安石榴苷對CPD的抑制效果。由此可見(jiàn)，安石榴苷對UVB誘導光損傷的修復依賴(lài)于SIRT1蛋白的調控。本實(shí)驗在文獻[19]的基礎進(jìn)一步證明了安石榴苷經(jīng)單層Caco-2細胞模型轉運后仍可發(fā)揮SIRT1蛋白的激活劑作用，促進(jìn)UVB誘導的光損傷的修復。其原因可能是SIRT1蛋白可負調控p53乙?；⒁种艭-Jun氨基末端激酶的激活，從而減弱紫外線(xiàn)誘導的細胞凋亡[28]，還可通過(guò)調控XPC基因轉錄在UVB誘導DNA損傷的修復中發(fā)揮作用[29]。
研究[30]發(fā)現，UVB誘導產(chǎn)生的DNA損傷主要通過(guò)NER系統進(jìn)行修復。DNA損傷識別階段，NER系統有全基因組修復(GGR)和轉錄偶聯(lián)修復(TCR)2條子路徑[31]。在GGR中，XPC-HR23B蛋白復合物與著(zhù)色性干皮病基因組E蛋白(XPE蛋白)通過(guò)識別 DNA 損傷位點(diǎn)啟動(dòng)修復反應[32]。安石榴苷對HaCaT細胞內XPC基因的mRNA轉錄水平影響如圖3所示。由圖3可知，安石榴苷顯著(zhù)上調了XPC基因的轉錄水平，這表明安石榴苷經(jīng)單層Caco-2細胞模型吸收轉運后可通過(guò)增強XPC基因的表達促進(jìn)光損傷的修復。有研究表明，氧化應激會(huì )抑制NER途徑對DNA損傷的修復[33]，NER途徑的激活與抗氧化活性相關(guān)[34]，而安石榴苷作為SIRT1蛋白的激活劑，對光損傷修復的促進(jìn)作用可能是由于其較強的抗氧化活性。
圖3 安石榴苷對HaCaT細胞內XPC基因的mRNA轉錄水平影響Fig.3 Effects of Punicalagin on XPC mRNA transcription levels in HaCaT cells
圖4 安石榴苷對HaCaT細胞內XPA蛋白乙?；降挠绊慒ig.4 Effects of punicalagin on the acetylation level of XPA in HaCaT cells
XPA蛋白在DNA損傷驗證環(huán)節中發(fā)揮作用，并作為分子支架通過(guò)蛋白質(zhì)間的相互作用在損傷位點(diǎn)附近召集其他NER核心因子[35]以完成后續的損傷修復工作。UVB照射條件下，安石榴苷對HaCaT細胞內XPA蛋白乙?；降挠绊懭鐖D4所示。由圖4可知，安石榴苷顯著(zhù)降低了Mock細胞中XPA蛋白乙?；?；
慢病毒轉導敲低SIRT1基因表達明顯抑制了安石榴苷對XPA蛋白乙?；降挠绊?。綜上所述，在腸-皮膚共培養體系中，安石榴苷以SIRT1基因依賴(lài)的方式上調了NER途徑相關(guān)的XPA蛋白去乙?；?。這可能是由于UVB照射后，SIRT1蛋白與XPA蛋白結合，使其處于低乙?；癄顟B(tài)，從而調節NER途徑[36]。在NER途徑中，DNA損傷被識別后，TFIIH復合物在損傷部位周?chē)忾_(kāi)DNA鏈，XPA蛋白和復制蛋白A(RPA)分別與DNA的損傷部位和未受損部位結合，允許內切酶結合并切除受損DNA鏈[37]。而SIRT1蛋白對XPA蛋白的調控能增強XPA蛋白與RPA蛋白相互作用的能力[36]，優(yōu)化NER途徑。盡管本文闡述了安石榴苷在腸-皮膚共培養體系中抑制UVB誘導的光損傷的可能機制，但安石榴苷在經(jīng)過(guò)腸道吸收后是以何種形式作用于HaCaT細胞從而發(fā)揮保護作用仍有待深入研究。
本文構建了Caco-2細胞與HaCaT細胞的腸-皮膚共培養體系，發(fā)現安石榴苷在經(jīng)過(guò)單層Caco-2細胞模型吸收轉運后仍可促進(jìn)UVB誘導的光損傷的修復，其作用機制可能與激活NER途徑相關(guān)的XPC基因轉錄水平及以SIRT1基因依賴(lài)的方式提高XPA蛋白去乙?；较嚓P(guān)。本研究為篩選能夠激活SIRT1蛋白的天然活性成分提供了可行的體外模型，并提示了SIRT1蛋白的激活劑在促進(jìn)修復UVB誘導的皮膚損傷中的重要性，也為安石榴苷作為膳食活性成分的開(kāi)發(fā)提供了理論依據，有利于促進(jìn)石榴資源的綜合開(kāi)發(fā)利用。后續研究工作將利用動(dòng)物模型進(jìn)一步闡明安石榴苷的生物活性和分子作用機制。
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