高效液相色譜法測定染發(fā)劑中4,種限用成分

李麗，楊樣，孫姍姍，王文強，錢(qián)凱，鄒潔

（江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監督研究院，江蘇南京 210007）

目前文獻報道的染發(fā)劑檢測方法主要有高效液相色譜法[1]、液質(zhì)聯(lián)用法[2，3]、氣相色譜 法[4]、氣質(zhì)聯(lián)用法[5]及毛細管電泳法[9]等。其中液相色譜-質(zhì)譜法應用最為廣泛，但質(zhì)譜儀器成本較高，且在分析復雜樣品及成分含量未知的樣品時(shí)， 易造成離子源污染；
氣相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用和毛細管電泳法在分析復雜樣品時(shí)易造成對毛細管柱和儀器污染，定性和定量不準確；

而高效液相色譜法具有儀器普及率較高、靈敏度高以及分析速度快等特點(diǎn)。由于染料成分具有極性強，不易揮發(fā)，不穩定等特點(diǎn)，因此高效液相色譜法是目前優(yōu)先選擇的檢測手段。染發(fā)劑中2,6-二羥乙氨基甲苯、3-硝基對羥乙氨基酚、2-氨基-6-氯-4-硝基苯酚、5-氨基-4-氯鄰甲酚4 種限用物質(zhì)的檢測方法， 目前國家暫未出臺統一的檢測標準，文獻報道也不多見(jiàn)，存在檢測方法缺失、職能部門(mén)無(wú)法監管的現象，因此本研究采用高效液相色譜法檢測染發(fā)劑中4 種限用物質(zhì)，并利用此方法對市售染發(fā)劑產(chǎn)品進(jìn)行檢測，為化妝品的市場(chǎng)監督提供技術(shù)支持[6～9]。

1.1 儀器與試劑

LC1260 高效液相色譜儀 （Agilent 公司，美國）；
電子分析天平（賽多利斯，德國）；
超純水機（Millipore，美國）；
超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司，中國）；
高速冷凍離心機（Thermo Fisher，美國）；
渦旋振蕩器（其林貝爾，中國）；
4 種限用物質(zhì)：2,6-二羥乙氨基甲苯（CAS：149330-25-6）、3-硝基對羥乙氨基酚（CAS：65235-31-6）、2-氨基-6-氯-4-硝基苯酚（CAS：6538-09-4）、5-氨基-4-氯鄰甲酚（CAS：110102-86-8），標準品均購于上海安譜實(shí)驗科技股份有限公司；
乙腈（色譜純，Merk，德國），樣品為市售染發(fā)劑。

1.2 標準溶液的配制

精確稱(chēng)取2,6-二羥乙氨基甲苯、3-硝基對羥乙氨基酚、5-氨基-4-氯鄰甲酚2-氨基-6-氯-4-硝基苯酚4 種標準品各100mg（精確到0.1mg）分別置于10mL 棕色容量瓶中，加入1mL 亞硫酸氫鈉（2g/L）和40%乙腈-水溶液使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量分數為1.0g/L 的標準儲備溶液。將標準儲備溶液依次稀釋成質(zhì)量分數為5mg/L、10mg/L、20 mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L 的 系列混合標準溶液。

1.3 樣品處理

稱(chēng)取樣品0.5g（精確至0.001g），置25.0mL 離心管中，加入1mL 亞硫酸氫鈉（2g/L），少量40%乙腈-水溶液，混勻樣品后定容至刻度，渦旋30s 并冰浴超聲提取15min 后，以10000rpm/min 轉速離心8min，經(jīng)0.45μm 微孔濾膜過(guò)濾后，待測備用。

1.4 色譜條件

色譜柱：AgilentEclipseplusC18 （250mm×4.6 mm，5μm）；
流動(dòng)相：乙腈和20mmol/L 磷酸二氫鉀水溶液，4 種限用物質(zhì)混合標準溶液色譜圖見(jiàn)圖1；
梯度洗脫，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；
流速：1.0mL/min；
檢測波長(cháng)：250nm；
柱溫：25℃；
進(jìn)樣量：10μL，采用外標法定量。

圖1 4 種限用物質(zhì)混合標準溶液的高效液相色譜圖

表1 4 種限用物質(zhì)的梯度洗脫程序

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

標準方法中規定取樣量為0.5g， 提取溶劑為10mL50%乙醇水溶液。

按照標準方法在日常檢驗中發(fā)現：部分樣品提取液會(huì )乳化或凝結，離心后的上層液較混濁，難以通過(guò)0.45μm 微孔濾膜；
此外，在部分樣品配方中未見(jiàn)加入亞硫酸氫鈉或異抗壞血酸，制得的供試溶液容易氧化分解，影響測定結果。

為了消除染發(fā)劑中增稠劑和凝膠劑的影響，防止供試溶液被氧化，本方法加入硅藻土吸附增稠劑和凝膠劑， 并在提取溶液中加入1mL亞硫酸氫鈉（2g/L），提取溶液體積改為25mL 并在冰浴環(huán)境中超聲提取。

優(yōu)化后的前處理方法乳化凝結現象明顯減少，便于離心后取得上層清液。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗以20mmol/L 磷酸二氫鉀水溶液（pH=4.0）作為流動(dòng)相A 相，考察以甲醇或乙腈（B 相）作為有機相在相同梯度洗脫條件下4 種目標化合物的色譜行為。

結果表明：當以甲醇為有機相時(shí)，4 種目標化合物出現出峰時(shí)間緩慢、出峰延遲的現象，而以乙腈為有機相出峰時(shí)間快并能很好的分離各目標組分，且峰形尖銳對稱(chēng)，故本方法選擇乙腈作為有機相。

2.2.2 測定波長(cháng)的選擇 分別對4 種限用物質(zhì)標準溶液進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光全波長(cháng)掃描分析 （190～400nm）。

根據所測結果4 種目標物在250nm 左右區域都有吸收峰，因此本方法最終確定定量檢測波長(cháng)為250nm。

2.2.3 色譜柱溫度的選擇 色譜柱的溫度對于4種染發(fā)劑限用物質(zhì)的色譜保留行為及分離效果都具有一定的影響。

本研究考察了當色譜柱溫度在10～40℃范圍對色譜行為的影響。

實(shí)驗結果表明：當色譜柱溫度為25℃時(shí)，既保證了保留時(shí)間的穩定性， 同時(shí)也避免溫度過(guò)高引起目標化合物成分的變化， 因此本方法最終確定25℃為色譜柱溫。

2.3 方法的線(xiàn)性關(guān)系和定量限

將混合標準儲備溶液逐級稀釋得到的質(zhì)量分數為5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的混合標準工作溶液，按測定條件質(zhì)量分數由低到高依次進(jìn)樣分析，以4 種染發(fā)劑限用物質(zhì)的峰面積作為縱坐標， 質(zhì)量分數作為橫坐標繪制標準曲線(xiàn)，得到線(xiàn)性回歸方程。

4 種限用物質(zhì)的線(xiàn)性回歸方程、線(xiàn)性回歸系數、檢出限(S/N＞3)及定量下限(S/N＞10)結果見(jiàn)表2。

結果表明：在5～200mg/L 質(zhì)量分數范圍內，各染發(fā)劑限用物質(zhì)的峰面積和對應的質(zhì)量分數具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數均大于0.999，且本方法的檢出限完全滿(mǎn)足實(shí)際樣品的分析要求。

表2 4 種限用物質(zhì)的線(xiàn)性方程、線(xiàn)性相關(guān)系數、檢出限及定量限

2.4 方法的回收率和精密度

利用空白基質(zhì)進(jìn)行回收率和精密度的考察。在低、中、高3 個(gè)加標水平下，每個(gè)加標水平平行測定6 次，結果表明4 種限用物質(zhì)的平均回收率范圍在87.6%～97.5%，相對標準偏差范圍在1.18%～4.64%，RSD 均小于5%（見(jiàn)表3），說(shuō)明該方法的準確度、精密度均好。

表3 4 種限用物質(zhì)的加標回收率和精密度結果(n=6)

2.5 樣品的測定

本次實(shí)驗共購買(mǎi)10 種染發(fā)劑，利用本文建立的方法進(jìn)行檢測，10 種樣品中均未檢出4 種限用物質(zhì)染料，符合《化妝品安全技術(shù)規范》（2015 年版）規定。

本研究建立了高效液相色譜法測定染發(fā)劑中4種限用物質(zhì)的檢測方法。

該方法前處理簡(jiǎn)單、重現性好、靈敏度高，可用于染發(fā)產(chǎn)品中常用染料成分的測定，為市場(chǎng)監管提供強有力的技術(shù)手段支撐。