張文梅，歐陽(yáng)冬梅，顏牛生，肖劉華，王印寶，向妙蓮*
水楊酸和2, 1, 3-苯并噻二唑誘導煙草抗赤星病的效應研究
張文梅1，歐陽(yáng)冬梅2，顏牛生3，肖劉華4，王印寶4，向妙蓮4*
（1. 撫州市煙草公司廣昌分公司，江西 廣昌 344900；
2. 宜春市農業(yè)農村局，江西 宜春 336000；
3. 萍鄉市蓮花縣農業(yè)農村局，江西 蓮花 337100；
4. 江西農業(yè)大學(xué) 農學(xué)院，江西 南昌 330045）
【目的】為探索外源物質(zhì)水楊酸（salicylic acid，SA）和2, 1, 3-苯并噻二唑（2, 1, 3-Benzothiadiazole，BTH）誘導煙草抗赤星病的效應?！痉椒ā窟x用紅花大金元煙草幼苗為試驗材料，分別用0.25～2.0 mmol/L SA和0.1～2.0 mmol/L BTH噴施煙草幼苗，48 h后接種赤星病菌（），測定病斑直徑以篩選SA和BTH誘導煙草抗赤星病的最適濃度?；诖?，用上述最佳誘導濃度SA和BTH預處理煙草葉片后接種赤星病菌，測定煙草幼苗葉片過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）等防御酶的活性以及丙二醛（MDA）含量?！窘Y果】0.5～2.0 mmol/L SA預處理煙草幼苗，其病斑直徑均明顯低于對照組，其中2.0 mmol/L SA處理的誘導效果最佳為23.01%；
0.1～0.5 mmol/LBTH可有效降低煙草病斑直徑，以0.2 mmol/L BTH的誘導效果最佳，為22.43%；
最佳誘導濃度SA和BTH處理組的CAT、POD和PPO防御酶活性在接種后15 d內顯著(zhù)高于對照組，而MDA含量則低于對照組，表明外源SA和BTH對赤星病的誘導抗性作用，可能與其提高煙草防御酶活性并降低MDA含量有關(guān)?！疽饬x】上述研究將為煙草赤星病防控提供理論參考。
水楊酸；
2, 1, 3-苯并噻二唑；
煙草赤星??；
誘導抗??；
防御酶
【研究意義】鏈格孢屬是重要的植物病原菌[1]，其孢子種類(lèi)多樣，已有報道該病原菌可引起黃瓜葉斑病、梨黑斑病和柑橘黑腐病等多種植物發(fā)病[2-4]，影響果實(shí)品質(zhì)，降低產(chǎn)量，造成嚴重經(jīng)濟損失，給農林作物帶來(lái)巨大的危害。由鏈格孢菌（）引起的煙草赤星病是危害煙草的重要病害之一[5]，該病具有潛育期短、流行范圍廣、暴發(fā)速度快和危害程度大等特點(diǎn)，嚴重影響煙葉的產(chǎn)量與品質(zhì)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】水楊酸（salicylic acid，SA），即鄰羥基苯甲酸，是一種植物體內重要的調節物質(zhì)，其與植株生長(cháng)發(fā)育以及抵御不良生物及非生物因子密切相關(guān)，在植物體內發(fā)揮重要的信號傳導作用[6]。當植物遭受病原物侵染后，體內SA急劇增加，可激發(fā)寄主植物提高免疫反應[7]。前人研究表明，外源SA處理可以提高對大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)[8]、芒果炭疽病[9]和庫爾勒香梨黑頭病[10]等抗性。2, 1, 3-苯并噻二唑（2, 1, 3-Benzothiadiazole，BTH）是一種非生物源植物抗病激活劑。外源BTH處理，可激發(fā)植物免疫系統從而誘導植物產(chǎn)生具有廣譜性和持久性的系統獲得抗性，誘導植物對蘋(píng)果青霉病和煙草青枯病等真菌和細菌病原物產(chǎn)生廣譜抗性[11-13]。
【本研究切入點(diǎn)】目前對煙草赤星病主要采用化學(xué)防治的方法，如蔡梁等[14]和陳玉國等[15]試驗表明56%啶?！る烤ゼ?5%多抗霉素可濕性粉劑等殺菌劑對煙草赤星病有較好的抑制作用。此外，亦有報道顯示利用中草藥提取物質(zhì)和生防菌哈茨木霉等可顯著(zhù)誘導煙草抗赤星病[16-17]。但有關(guān)SA和BTH誘導煙草抗赤星病的效應及其與相關(guān)防御酶活性的關(guān)系研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以煙草幼苗（紅花大金元）為試驗材料，通過(guò)外源SA和BTH處理，探究SA和BTH誘導煙草植株抗赤星病的效應與相關(guān)防御酶活性的關(guān)系，以期為煙草赤星病的防治提供參考。
煙草催芽包衣種子（紅花大金元）：來(lái)自玉溪中煙種子有限責任公司。試驗前于育苗溫室（28±1℃）培養，十字期待用。
鏈格孢菌（）：江西農業(yè)大學(xué)農學(xué)院植物病理實(shí)驗室提供。
抗病誘導劑：水楊酸（SA）購自天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)，2, 1, 3-苯并噻二唑（BTH）購自北京索萊寶科技有限公司，試驗前用蒸餾水定容至試驗所需濃度，待用。
1.2.1不同濃度SA和BTH處理誘導煙草抗赤星病效應取1.1中煙草幼苗，分別用0.25，0.50，0.75，1.0，2.0 mmol/L SA和0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 mmol/L BTH葉面噴施幼苗葉片，每株噴施15 mL，以蒸餾水處理為對照，每處理3次重復，每重復6株煙草。48 h后，用無(wú)菌接種針在煙草葉片正面刺傷小孔，接種10mL濃度為1.0×106conidia/mL的孢子懸浮液，接種后置發(fā)病室（溫度28 ℃，相對濕度95%），逐日測定病斑直徑。按以下公式計算誘導效果，篩選最佳誘導抗病濃度。
誘導效果=（對照組病斑直徑-處理組病斑直徑）/對照組病斑直徑×100%（1）
方法同上，以最佳誘導濃度的SA和BTH噴施煙草幼苗并接種，分別于接種后0，3，6，9，12，15 d取病健交界處組織（2 cm），加入液氮冷凍后迅速研磨成粉末狀，裝入取樣袋，于-80 ℃條件下保存備用。
1.2.2抗病相關(guān)指標測定取1.2.1樣品，測定煙草幼苗葉片過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）等抗病相關(guān)防御酶活性以及丙二醛（MDA）含量。
POD測定方法：采用愈創(chuàng )木酚法[18]。取一支試管，向試管中加入1.2.1中煙草樣品0.15 g，快速研磨之后轉移至10 mL離心管中，加入2.0 mL含有1 mmol聚乙二醇6 000（PEG）、4%聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）和1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）的pH為5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液，于漩渦混合器上混合均勻，均勻后于4 ℃，1 200 r/min離心30 min，取上清液備用。取上清液0.5 mL，25 mmol/L愈創(chuàng )木酚溶液3.0 mL以及0.5 mol/L過(guò)氧化氫溶液200 μL，將反應混合液放入石英比色皿中用分光光度計法測得樣品在波長(cháng)470 nm下的吸光度，單位為ΔOD470/(min·g)。POD活性的計算公式為：
U=（ΔOD470×）/（×）（2）
式（2）中：煙草樣品提取液總體積，mL；
：測定時(shí)所取煙草樣品提取液體積，mL；
：煙草樣品質(zhì)量，g。
PPO測定方法：采用鄰苯二酚法[18]。上清液制備同POD；
取上清液100 μL，加入50 mmol/L鄰苯二酚溶液1.0 mL以及50 mmol/L、pH為5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液4.0 mL，將這些反應混合液放入石英比色皿中測得樣品在波長(cháng)為420 nm下的吸光度，單位是ΔOD420/(min·g)。PPO活性的計算公式為：
U=（ΔOD420×）/（×）（3）
式（3）中：煙草樣品提取液總體積，mL；
：測定時(shí)所取煙草樣品提取液的體積，mL；
：煙草樣品質(zhì)量，g。
CAT測定方法[18]：取一支試管置冰浴條件，稱(chēng)取1.2.1中煙葉樣品0.15 g，加50 mmol/L、pH為7.5磷酸緩沖液5 mL，置漩渦混合器上混合均勻，于4 ℃、9 500 r/min離心20 min。取上清液0.1 mL，加入20 mmol/L過(guò)氧化氫溶液2.9 mL制成混合液放入石英比色皿中，測定樣品在波長(cháng)240 nm的吸光度。單位為ΔOD240/(min·g)。CAT活性的計算公式為：
U=（ΔOD240×）/（0.01××）（4）
式（4）中：煙草樣品提取液總體積，mL；
：測定時(shí)所取煙草樣品提取液的體積，mL；
：煙草樣品質(zhì)量，g。
MDA含量測定[18]：取1.2.1中的煙草樣品0.15 g放入試管中，于冰浴條件下加入7 mL 100 g/L三氯乙酸（TCA）溶液，將試管中的混合液放在漩渦混合器中混合均勻，之后于4 ℃，9 500 r/min離心20 min；
取上清液2.0 mL，加入0.67% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液2 mL，混合均勻后沸水煮20 min，迅速冷卻后4 000 r/min離心15 min。取上清液，測定上清液分別在450，532，600 nm波長(cháng)處的OD值，并以0.67%的TBA溶液為空白對照。按下式計算MDA含量：
MDA（mmol/g）=[6.452×（A532-A600）-0.559×A450]×[/（×）]（5）
式（5）中：煙草樣品提取液總體積，mL；
：測定時(shí)所取煙草樣品提取液的體積，mL；
：煙草樣品質(zhì)量，g。
試驗數據的統計分析方法采用Excel 2016和SPSS17.0，并用Duncan’s新復極差法進(jìn)行多重比較，處理的顯著(zhù)水平<0.05。
如表1所示，0.25～2.0 mmol/L濃度SA處理煙草葉片，除0.25 mmol/L SA處理組病斑直徑與對照無(wú)顯著(zhù)差異外（<0.05），其它4組濃度SA處理可顯著(zhù)降低煙草幼苗赤星病病斑直徑。當SA濃度為2.0 mmol/L時(shí)，誘導效果達最高值，為23.01%；
當0.1～0.5 mmol/L濃度BTH可顯著(zhù)誘導煙草抗赤星病，其中BTH濃度為0.2 mmol/L時(shí)，最佳誘導效果達22.43%（<0.05），但當濃度升高至1.0～2.0 mmol/L時(shí)，其病斑直徑反而大于對照組直徑，BTH對煙草誘導抗赤星病表現為負調控。
表1 不同濃度SA和BTH預處理誘導煙草幼苗抗赤星病的效應
表中數據代表試驗結果3次重復的平均值±標準誤。同列數據之間互相比較，不同字母表示處理之間在<0.05水平差異顯著(zhù)。
由圖1A可知，用SA最佳誘導濃度2.0 mmol/L處理煙草幼苗，其病斑直徑在接種后3～15 d均明顯小于對照組病斑直徑；
接種后12 d，SA誘導效果最佳為28.6%（圖1B），顯著(zhù)高于其它接種后時(shí)間點(diǎn)（<0.05）。0.2 mmol/L BTH處理煙草幼苗，接種后15 d，BTH處理病斑直徑均顯著(zhù)小于對照組（圖1A）；
圖1B顯示接種后3～15 d，BTH對煙草幼苗的誘導效應隨時(shí)間變化先上升后下降，在9 d時(shí)出現峰值，誘導效果為24.89%。
A：SA和BTH處理接種A. alternate后15 d，煙草葉片病斑直徑；
B：SA和BTH處理誘導煙草葉片抗赤星病的效應；
不同字母表示差異顯著(zhù)（P<0.05）。
如圖2A所示，除接種后3 d，兩處理組的CAT活性均顯著(zhù)高于對照組，其中接種后5 d，SA處理組和BTH處理組的CAT活性分別為對照組的1.94倍和1.27倍。SA和BTH處理后接種煙草葉片POD活性如圖2B。接種后15 d內，處理組POD活性始終高于對照組，在接種后的15 d，SA和BTH處理組POD活性達到最大值，分別為對照組的1.81倍和1.89倍（<0.05）。圖2C中，SA和BTH處理組PPO活性于接種后9 d達最大值，依次為對照組的2.37倍和1.54倍。相反，由圖2D所示，SA和BTH處理后煙草葉片MDA含量在接種后15 d內，除9 d外均低于對照組。
外源SA和BTH對大多數植物的生理作用具有“低促高抑”雙重性，因其施用濃度和器官種類(lèi)不同，既有促進(jìn)效應又有抑制效應。本研究結果表明，0.25～2.0 mmol/L SA和0.1～2.0 mmol/L BTH預處理煙草幼苗，SA對其誘導效應隨濃度升高而增強，BTH則在濃度為0.2 mmol/L時(shí)誘導效應達到最高值，但當濃度繼續升高反而促進(jìn)發(fā)病，上述SA和BTH在其濃度范圍內效應不盡相同，說(shuō)明不同外源誘導劑的最佳誘導效應因其種類(lèi)不同而各異。就SA而言，在0.25～2.0 mmol/L范圍內，SA誘導效應隨濃度升高不斷增強，暗示SA低促高抑現象在上述濃度范圍內尚無(wú)表現效應轉折點(diǎn)，或者SA誘導煙草抗赤星病亦可能沒(méi)有濃度效應。反之，BTH在0.1～2.0 mmol/L則表現明顯的雙重效應：當濃度為0.2 mmol/L時(shí)，誘導效果達最高值，然后隨濃度升高逐漸下降；
當濃度升高至2.0 mmol/L時(shí)，反而促進(jìn)煙草赤星病的發(fā)生，上述結果與張廣旭[19]和劉曉佳等[20]試驗結果類(lèi)似。說(shuō)明不同外源物質(zhì)誘導不同寄主抵御不同病害其最適濃度不盡相同，可能與外源物質(zhì)-寄主-病原互作模式有關(guān)。
POD是酚類(lèi)、植保素合成的重要酶，同時(shí)具有清除超氧陰離子自由基的作用；
CAT和PPO與植物的代謝強度及抗病能力密切有關(guān)，兩者均可分解細胞內的過(guò)氧化氫避免細胞受到毒害，提高防御能力；
植物組織細胞膜受損程度與組織中積累的MDA含量相關(guān)，病原菌侵染會(huì )導致植物組織中MDA含量明顯上升，MDA含量則可以反映逆境對植物細胞造成的損傷程度[21]。植物在遭受逆境脅迫時(shí)，為保持組織內活性氧代謝平衡，采取調節CAT、POD、PPO等抗氧化酶活性和MDA含量的方式，來(lái)減緩細胞內活性氧自由基積累及膜脂過(guò)氧化帶來(lái)的傷害[22]。許倩倩[23]研究表明，0.5 mmol/L SA和0.5 mmol/L BTH能有效提高甘藍幼苗抗氧化酶活性及降低MDA含量，提高幼苗對根腫病的抗性。本試驗結果表明采用外源2.0 mmol/LSA和0.2 mmol/L BTH噴施處理煙草接種赤星病菌后，處理組CAT、POD、PPO等抗氧化酶的活性高于對照，表明外源SA和BTH可通過(guò)提高植物組織中活性氧化酶活性和減少MDA對植株造成的傷害，從而提高植株的抗病性，與耿莉娜等[24]在不同品種煙草接種赤星病菌后防御酶活性變化的研究結果一致。
綜上所述，外源SA和BTH預處理煙草幼苗赤星病病，可能通過(guò)調控防御酶活性，減輕MDA積累，延緩膜脂過(guò)氧化，從而緩解病害的發(fā)生。有關(guān)SA和BTH誘導煙草幼苗抗赤星病的分子機制有待后續研究。
[1] 馮中紅, 孫廣宇. 鏈格孢屬及相關(guān)屬分類(lèi)研究新進(jìn)展[J]. 菌物研究, 2020, 18(4): 294-303.
[2] 劉行風(fēng), 劉東, 陶磊, 等. 黑龍江省黃瓜鏈格孢葉斑病病原鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 中國蔬菜, 2021(8): 80-86.
[3] 王文青, 李揚, 向均, 等. 我國梨產(chǎn)區引起黑斑病的鏈格孢種類(lèi)鑒定與致病性研究[J]. 果樹(shù)學(xué)報, 2020, 37(12):1922-1933.
[4] 張斌. 中國柑橘黑腐病和褐斑病病原菌的系統發(fā)育分析及褐斑病菌中的兩個(gè)Rho GTPases基因功能研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2020.
[5] 王雯麗, 曾慶超, 李燕, 等. 煙草赤星病拮抗芽胞桿菌的篩選、鑒定及促生防病作用[J]. 中國煙草科學(xué), 2021, 42(2): 43-49.
[6] 汪尚, 徐鷺芹, 張亞仙, 等. 水楊酸介導植物抗病的研究進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)報, 2016, 52(5): 581-590.
[7] 谷曉勇, 劉揚, 劉利靜. 植物激素水楊酸生物合成和信號轉導研究進(jìn)展[J]. 遺傳, 2020, 42(9): 858-869.
[8] 賴(lài)宏祉. 水楊酸和茉莉酸在大豆與胞囊線(xiàn)蟲(chóng)互作中對基因表達的影響[D]. 沈陽(yáng): 沈陽(yáng)農業(yè)大學(xué), 2020.
[9] 何俊瑜, 顧津羽, 胡春梅, 等. 水楊酸與硝普鈉對采后芒果果實(shí)炭疽病抗性和苯丙烷代謝的協(xié)同誘導效應[J]. 食品科學(xué), 2022, 43(3): 178-186.
[10] 李自芹, 郭慧靜, 魏曉春, 等. 水楊酸對庫爾勒香梨黑頭病抑制及貯藏品質(zhì)的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2022, 43(8): 329-335.
[11] 張越, 楊冬燕, 張乃樓, 等. 植物抗病激活劑研究進(jìn)展[J]. 中國科學(xué)基金, 2020, 34(4): 519-528.
[12] 李生娥. 采后BTH處理及挑戰接種對蘋(píng)果果實(shí)抗青霉病的誘導[D]. 蘭州: 甘肅農業(yè)大學(xué), 2017.
[13] 李盼盼. 苯并噻二唑(BTH)和硅(Si)誘導煙草抗青枯病機理的研究[D]. 重慶: 西南大學(xué), 2016.
[14] 蔡梁, 胡長(cháng)志, 張文梅, 等. 不同殺菌劑對煙草赤星病菌室內毒力測定[J]. 生物災害科學(xué), 2021, 44(4): 465-468.
[15] 陳玉國, 董寧禹, 霍正威, 等. 幾種農藥對煙草赤星病的防治效果[J]. 浙江農業(yè)科學(xué), 2021, 62(12): 2490-2492.
[16] 張家美. 中草藥提取物對煙草赤星病的誘導抗性研究[D]. 貴陽(yáng): 貴州大學(xué), 2017.
[17] 錢(qián)發(fā)聰, 李夢(mèng)嬌, 張廷金, 等. 哈茨木霉菌LTR-2對煙草赤星病的田間防治效果[J]. 昆明學(xué)院學(xué)報, 2021, 43(3): 20-23.
[18] 曹建康, 姜微波, 趙玉梅. 果蔬采后生理生化實(shí)驗指導[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 2007.
[19] 張廣旭. 鈣和水楊酸在增強番茄抗灰霉病中的互作關(guān)系研究[D]. 沈陽(yáng): 沈陽(yáng)農業(yè)大學(xué), 2020.
[20] 劉曉佳, 薛耀碧, 周雅涵, 等. 苯并噻二唑處理對柑橘果實(shí)采后病害控制效果及機制分析[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(9): 215-223.
[21] 安曉霞, 曾糧斌, 余永廷, 等. 三種誘抗劑處理對苧麻葉片PPO和POD活力的影響[J]. 中國麻業(yè)科學(xué), 2014, 36(1): 46-50.
[22] HAMEED A, GOHER M, IQBAL N. Drought induced programmed cell death and associated changes in antioxidants proteases and lipid peroxidation in wheat leaves[J]. Biologia plantarum, 2013, 57(2): 370-374.
[23] 許倩倩. 水楊酸(SA)和苯并噻二唑(BTH)對甘藍根腫病抗性相關(guān)生理指標的影響[D]. 重慶: 西南大學(xué), 2015.
[24] 耿莉娜, 龍艷玲, 徐宸,等. 感染赤星病后不同煙草品種葉片防御酶的變化[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2018, 40(10): 19-24.
Effects of Salicylic Acid and 2, 1, 3-Benzothiadiazole Inducing Tobacco Against Brown Spot
ZHANG Wenmei1, OUYANG Dongmei2, YAN Niusheng3, XIAO Liuhua4, WANG Yinbao4, XIANG Miaolian4*
（1.Guangchang Branch of Fuzhou Tobacco Company, Guangchang, Jiangxi 344900, China; 2. Yichun Bureau of Agricultural and Rural Affairs, Yichun, Jiangxi 336000, China; 3. Lianhua Bureau of Agricultural and Rural Affairs, Lianhua, Jiangxi 337100, China; 4. School of Agronomy Sciences, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China）
In this study, tobacco seedlings were used to investigate the effects of salicylic acid (SA) and 2, 1, 3-Benzothiadiazole (BTH) inducing resistance to brown spot.Tobacco seedlings were sprayed with 0.25～2.0 mmol/L SA and 0.1～2.0 mmol/LBTH, respectively, and inoculated with48 h later, and then the lesion diameters was determined to get the optimum concentrations of SA and BTH. Based on this, the defense enzyme activities of seedlings, including catalase (CAT), peroxidase (POD) and polyphenol oxidase (PPO) were measured after being treated with the optimum induction concentrations of SA and BTH.The results showed that the lesion diameters of tobacco leaves treated with 0.5～2.0 mmol/L SA and 0.1～0.5 mmol/L BTH were all smaller than that of the control group, and the best induced effect was 23.01% (2.0 mmol/L SA) and 22.43% (0.2 mmol/L BTH), respectively. Compared with the control, the activities of CAT, POD and PPO were mostly significantly enhanced while the MDA content was reduced within 15 days after inoculation. It was indicated that the induced resistance of exogenous SA and BTH to brown spots may be related to the increase of defense enzyme activity and the decrease of MDA content in tobacco.This study provided theoretical references for the control over tobacco brown spots.
salicylic acid; 2, 1, 3-Benzothiadiazole; tobacco brown spot; induced disease resistance; defense enzymes
S435.72
A
2095-3704（2022）03-0318-06
張文梅, 歐陽(yáng)冬梅, 顏牛生, 等. 水楊酸和2, 1, 3-苯并噻二唑誘導煙草抗赤星病的效應研究[J]. 生物災害科學(xué), 2022, 45(3): 318-323.
10.3969/j.issn.2095-3704.2022.03.52
2022-07-07
2022-08-16
江西省自然科學(xué)基金項目（20192BAB204018）
張文梅（1985—），女，碩士，主要從事煙草病蟲(chóng)害防治，zhwmly@163.com；
*通信作者：向妙蓮，副教授，博士，mlxiang@jxau.edu.cn。
