骨關(guān)節炎免疫工程治療策略

鄧青松 張長(cháng)青 陶詩(shī)聰

骨關(guān)節炎是一種慢性退行性骨關(guān)節疾病，以關(guān)節軟骨損壞、軟骨下骨改變、骨贅形成和關(guān)節滑膜炎癥為主要特征，臨床表現為關(guān)節疼痛、腫脹、僵硬、功能喪失等[1]。過(guò)去幾十年，全世界骨關(guān)節炎發(fā)病人數不斷上漲，已成為嚴重的公共衛生問(wèn)題。然而，目前骨關(guān)節炎的發(fā)病機制尚未完全闡明，治療手段依舊有限，絕大多數治療方式只能緩解疼痛等癥狀。

隨著(zhù)對骨關(guān)節炎認識的逐漸加深，骨關(guān)節炎不再被簡(jiǎn)單認為是年齡增長(cháng)導致的關(guān)節退行性疾病，而是由多種因素共同導致，其中免疫因素和局部組織破壞及代謝紊亂導致的慢性炎癥在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中占有重要地位[2]。炎癥因子白細胞介素（IL）-1 和腫瘤壞死因子（TNF）- 在骨關(guān)節炎中發(fā)揮了重要作用，它們能夠在關(guān)節軟骨及滑膜中刺激其他炎癥因子釋放，激活軟骨破壞相關(guān)蛋白酶，抑制膠原合成，加重軟骨基質(zhì)降解[3]。這些免疫調節方式和分子都有可能成為治療靶點(diǎn)，同時(shí)也為臨床康復治療提供可靠的理論依據，有望緩解骨關(guān)節炎患者疼痛，提高患者生活質(zhì)量。

近年來(lái)，免疫工程受到越來(lái)越多的關(guān)注，它是運用工程化思想和方式如通過(guò)生物材料、細胞調節和基因工程等對免疫系統進(jìn)行調節的新型學(xué)科[4]。雖然目前一些抗細胞因子的免疫療法在骨關(guān)節炎治療中取得一定的療效，但長(cháng)期使用高劑量的藥物可能會(huì )帶來(lái)不良反應和脫靶效應。為了實(shí)現對骨關(guān)節炎免疫的精確控制，基于免疫工程策略的骨關(guān)節炎治療方案應運而生。通過(guò)生物材料載體和基因工程調節免疫細胞激活的關(guān)鍵信號通路及關(guān)節常駐細胞活動(dòng)，有望為骨關(guān)節炎治療提供新的方案。

骨關(guān)節炎中產(chǎn)生的大量炎癥因子不僅會(huì )破壞軟骨，而且會(huì )激活下游許多蛋白水解酶。在這些炎癥因子中IL-1 和TNF- 占有重要地位，它們在滑膜、軟骨及軟骨下骨細胞內都有顯著(zhù)增加，不僅會(huì )破壞軟骨，而且會(huì )驅動(dòng)骨關(guān)節炎的炎癥級聯(lián)反應[5]，導致IL-6、IL-8、一氧化氮（NO）、前列腺素（PG）-E2 等細胞因子分泌，進(jìn)一步增加金屬蛋白酶的生成，抑制膠原蛋白、蛋白多糖等分子合成[2]。此外，IL-1 和TNF- 還會(huì )誘導活性氧（ROS）產(chǎn)生，抑制過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶表達，促進(jìn)ROS 在關(guān)節腔內聚集，加速軟骨降解。

IL-1 及TNF- 的代謝過(guò)程由絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷酯酰肌醇-3-激酶（PI3K）/Akt和核因子（NF）- B 等信號通路介導。NF- B 參與多種細胞活動(dòng)，不僅介導多種炎癥因子的表達，也參與金屬蛋白酶的誘導，而且與細胞增殖、分化、免疫應答等多種細胞活動(dòng)有關(guān)[6]。通常NF- B由p50 和p65 蛋白組成，靜息狀態(tài)時(shí)存在于細胞質(zhì)中，受到NF- B 抑制蛋白I B 的抑制。當細胞受到刺激后I B 發(fā)生磷酸化，NF- B 的p65 由細胞質(zhì)轉移到細胞核，從而作為轉錄因子促進(jìn)炎癥因子、生長(cháng)因子等介質(zhì)的表達[7]。

金屬蛋白酶作為IL-1 、TNF- 的下游炎癥物質(zhì)，在骨關(guān)節炎軟骨損傷中扮演重要角色，它會(huì )導致關(guān)節軟骨細胞外基質(zhì)組成成分降解，直接造成軟骨損害[8]。金屬蛋白酶包括基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）、血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶（ADAMTS）和去整合素-金屬蛋白酶（ADAM）[9]。其中MMP-13 在骨關(guān)節炎中居于核心地位，與正常軟骨相比，骨關(guān)節炎軟骨中MMP-13 高表達，會(huì )造成Ⅱ型膠原及蛋白多糖降解，導致過(guò)度的軟骨細胞外基質(zhì)降解，與此同時(shí)，軟骨破壞產(chǎn)生的一些碎片又會(huì )觸發(fā)軟骨內分解代謝相關(guān)基因的表達，進(jìn)而導致骨關(guān)節退行性變，誘發(fā)骨關(guān)節炎[10]。

以上免疫相關(guān)信號通路介導產(chǎn)生的炎癥因子及進(jìn)一步激活的蛋白酶在骨關(guān)節炎發(fā)病及進(jìn)展中占有重要地位。這些免疫調節方式和分子都可能成為骨關(guān)節炎免疫工程治療的靶點(diǎn)。

近年來(lái)，隨著(zhù)研究不斷深入，越來(lái)越多的天然或合成的納米、微米級載體材料用于骨關(guān)節炎治療的藥物遞送。常見(jiàn)載體有透明質(zhì)酸、殼聚糖、海藻酸鈉、聚己內酯、聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物等，它們通過(guò)自身的表面結構、電荷、蛋白粘附、親疏水性及pH 修飾等吸附或包裹搭載藥物[11]。以生物材料為基礎的骨關(guān)節炎免疫工程治療策略通過(guò)結合生物材料改變免疫調節藥物的藥物動(dòng)力學(xué)，增加藥物作用范圍及時(shí)間，解決藥物靶向性和藥物持久性的問(wèn)題[12]。

2.1 基于生物材料遞送系統的免疫工程治療

非甾體類(lèi)抗炎藥（NSAID）是目前廣泛應用的控制骨關(guān)節炎癥狀的藥物，能夠通過(guò)抑制環(huán)氧化物酶（COX）來(lái)減少PG、緩激肽的產(chǎn)生，進(jìn)而減少炎癥因子分泌，具有鎮痛、解熱、抗炎等效果[13]。然而，長(cháng)期全身給藥會(huì )增加胃腸道、心血管系統等不良事件發(fā)生的風(fēng)險。目前一些研究將雙氯芬酸鈉載入納米微球后注射入關(guān)節，這樣不僅實(shí)現雙氯芬酸鈉的緩釋?zhuān)行p緩雙氯芬酸鈉在關(guān)節內的代謝，減少巨噬細胞等分泌炎癥因子，而且載體微球也能起到潤滑關(guān)節的作用，減小關(guān)節內的摩擦[14]。

疾病修飾性骨關(guān)節炎藥物（DMOAD）如IL-1 、TNF- 抑制劑或單克隆抗體能夠靶向抑制IL-1 、TNF- 生成及作用，減少蛋白水解酶和炎癥因子合成，有效減緩骨關(guān)節炎進(jìn)程。然而，IL-1 受體拮抗劑（IL-1Ra）在關(guān)節腔內很快會(huì )被清除，降低了藥物的效能[15]。有研究將IL-1Ra 通過(guò)共價(jià)鍵結合到嵌段共聚物膠束上，體外實(shí)驗中搭載IL-1Ra的載體顆粒能夠維持IL-1Ra 的生物活性，靶向作用于軟骨細胞的IL-1 受體，且相較于將IL-1Ra 直接注射到關(guān)節腔內，注射膠束搭載的IL-1Ra 微粒能夠有效將IL-1Ra 的半衰期由原來(lái)的1 d 延長(cháng)到14 d[16]。

姜黃素具有很好的抗氧化、抗炎的特性，能通過(guò)MAPK、PI3K/Akt及NF- B信號通路抑制炎癥，但它的水溶性低、不穩定、吸收差、消除代謝快等缺陷限制了其應用[17]。目前有研究將姜黃素連接在兩性聚合物主干上，通過(guò)分子自組裝和親水疏水作用形成姜黃素納米顆粒，或外泌體、硫酸軟骨素等包裹姜黃素后進(jìn)行投遞，能有效提高姜黃素的穩定性和生物可利用度[18]。在動(dòng)物實(shí)驗中，局部注射生物材料搭載的姜黃素，能減少炎癥因子IL-1 、TNF- 、PG-E2、MMP-13 和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白表達，增加Ⅱ型膠原分泌，增強抗氧化酶活性，有效提高軟骨細胞增殖，促進(jìn)軟骨修復[6]。目前有臨床研究將姜黃素包裹在脂質(zhì)分子里形成脂質(zhì)姜黃素顆粒，脂質(zhì)分子能夠有效提高姜黃素的溶解性，增加口服后吸收進(jìn)入血液的劑量，隨血循環(huán)到達骨關(guān)節后能夠有效緩解癥狀[19]。

基于生物材料遞送系統的免疫工程治療方案不僅可以使一些骨關(guān)節炎傳統治療藥物重新煥發(fā)活力，而且給一些有骨關(guān)節炎治療潛力的新藥物提供了好的投遞方式。此外，基于生物材料的免疫工程治療不僅可以遞送骨關(guān)節免疫調節藥物，而且能與骨關(guān)節炎基因治療相結合起來(lái)。目前有研究用納米顆粒載體運送小干擾RNA（siRNA）來(lái)調節骨關(guān)節炎免疫，延緩骨關(guān)節炎進(jìn)展，這種結合了基因工程的免疫工程治療方式不僅能夠延長(cháng)siRNA 在關(guān)節內的作用時(shí)間，而且能夠靶向抑制關(guān)節內的異?；顒?dòng)，減輕關(guān)節腔內炎癥[20]。

Yan 等[21]針對抑制NF- B 信號通路設計了一種肽-siRNA 的納米微載體藥物傳遞系統。這種納米微載體能夠長(cháng)期作用于關(guān)節腔，同時(shí)運載的siRNA 能特異性降低關(guān)節細胞中NF- B 的p65 蛋白表達，不會(huì )影響其他組織中NF- B 途徑，能夠靶向性地減少關(guān)節炎軟骨細胞凋亡和滑膜炎活動(dòng)，從而抑制骨關(guān)節炎炎癥起始。IL-1 是骨關(guān)節炎中重要炎癥因子，它可以促進(jìn)MMP 的產(chǎn)生，導致關(guān)節軟骨膠原和蛋白多糖等細胞外基質(zhì)成分降解。IL-1Ra 能夠用來(lái)調控IL-1 的作用，但關(guān)節內注射IL-1Ra 的半衰期很短，這限制了其應用[16]。Zhang等[22]設計了一種負載IL-1 短發(fā)夾RNA（shRNA）的酵母微膠囊，通過(guò)口服途徑投遞，可以系統性地調節骨關(guān)節免疫系統，治療骨關(guān)節炎；
實(shí)驗證明，口服這種微顆?？蓽p少胃腸壁和關(guān)節腔內巨噬細胞的IL-1 、TNF- 等炎癥因子表達，減少關(guān)節腔內Ⅹ型膠原和MMP-13。MMP 作為炎癥因子的下游分子，能夠直接導致關(guān)節軟骨的軟骨細胞外基質(zhì)組成成分降解，且降解的成分會(huì )進(jìn)一步促進(jìn)炎癥發(fā)生。Bedingfield 等[23]設計了一種靶向MMP-13基因的siRNA 納米顆粒，局部注射后，它能選擇性地結合MMP-13 mRNA，抑制MMP-13 表達，從而起到保護關(guān)節軟骨免受損傷，減緩關(guān)節炎進(jìn)程的作用。

2.2 基于生物材料理化特性的免疫工程治療

基于生物材料理化特性的免疫工程治療方式是采用具有免疫調節功能的生物材料支架，利用支架的一些理化特性，調節骨關(guān)節炎免疫系統，促進(jìn)軟骨再生，實(shí)現骨關(guān)節炎免疫工程治療。

硫酸軟骨素是一種存在于軟骨細胞外基質(zhì)中的糖胺聚糖，它不僅能夠保持軟骨的完整性，而且具有抗炎、調節酶活性的作用[24]。在關(guān)節炎中，單純的硫酸軟骨素支架很快會(huì )被降解，所以常在硫酸軟骨素支架中加入一些其他成分如膠原、絲素等減緩其降解[25]。這樣制成的支架具有明顯的抗炎活性，將它植入動(dòng)物軟骨缺損中，不僅能夠保持軟骨細胞表型，而且在IL-1 誘導的軟骨炎癥中減少了相關(guān)炎癥分子如MMP-1、MMP-13、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和TNF- 等的表達，增強軟骨對慢性炎癥的調節能力和再生能力[26]。

透明質(zhì)酸由于能夠促進(jìn)蛋白聚糖合成、保持關(guān)節粘彈性和抗炎，被廣泛應用于骨關(guān)節炎的治療。關(guān)節內注射透明質(zhì)酸不僅能夠減輕疼痛，減少滑膜囊性纖維化，而且能夠抑制MMP、ADAMTS、解聚素等炎癥因子的表達及活性[27]。Shi 等[28]將苯硼酸連接到透明質(zhì)酸骨架上形成改性水凝膠，該水凝膠能夠通過(guò)3D 打印技術(shù)制成運載軟骨細胞的軟骨再生支架；
這種支架具有良好的抗ROS 性能，將其植入關(guān)節內能夠有效避免運載的細胞直接暴露在充滿(mǎn)ROS 的炎癥環(huán)境里，保護運載細胞的功能及表型，減少關(guān)節內IL-1 、TNF- 等炎癥因子，增強骨關(guān)節炎軟骨再生。

殼聚糖是一種結構類(lèi)似于糖胺聚糖的天然多聚物，擁有與軟骨多糖相似的結構，能夠促進(jìn)細胞粘附和間充質(zhì)干細胞增殖。殼聚糖及其衍生物能夠抑制IL-1 ，生物安全性高，因此常被用于軟骨修復相關(guān)的研究[29]。此外，殼聚糖納米微球能夠運載一些抗炎藥物，如通過(guò)與藥物相互作用形成殼聚糖微球、殼核結構等，運載小檗堿、地塞米松等抗炎藥[30]。

雖然基于生物材料的骨關(guān)節炎治療策略能夠有效解決當前的一些治療難題，但是這種策略依賴(lài)于關(guān)節內的常駐細胞群。然而，無(wú)論是伴隨年齡增長(cháng)的退行性骨關(guān)節炎還是創(chuàng )傷性關(guān)節炎，關(guān)節內的常駐細胞群及其數量都已發(fā)生改變[31]?；诖?，針對骨關(guān)節炎，以細胞為基礎的免疫工程療法應運而生。

間充質(zhì)干細胞具有很強的自我更新能力，能夠分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞，此外間充質(zhì)干細胞具有免疫調節再生能力，可廣泛用于骨關(guān)節炎免疫工程治療[32]。Liu 等[33]通過(guò)3D 打印技術(shù)制備了一種能夠攜帶骨髓間充質(zhì)干細胞的促進(jìn)骨軟骨缺損修復的多相支架，這種支架為骨髓間充質(zhì)干細胞在關(guān)節內的增殖和生長(cháng)營(yíng)造了良好的修復環(huán)境，能夠起到促進(jìn)Ⅱ型膠原生成，抑制IL-1 的作用。間充質(zhì)干細胞主要通過(guò)旁分泌方式分泌一些具有軟骨保護作用和抗炎效果的因子如蛋白酶抑制劑、IL-6和轉化生長(cháng)因子（TGF）- 等[34]。IL-4 是重要的抗炎細胞因子，它能夠通過(guò)減少一氧化氮合酶（NOS）和NO 的產(chǎn)生抑制IL-1 激活，起到保護軟骨細胞的作用，但在間充質(zhì)干細胞中IL-4 表達量很少[35]。Song 等[36]為了解決間充質(zhì)干細胞較少表達IL-4 的問(wèn)題，將IL-4 基因轉染到間充質(zhì)干細胞中以增強抗炎能力，然后將其聚集成細胞球后注射入關(guān)節炎模型的大鼠關(guān)節內；
實(shí)驗表明，此方法不僅延長(cháng)了間充質(zhì)干細胞在關(guān)節內的生存時(shí)間，而且有效增加了IL-4 的表達量，有明顯的抗炎效果和軟骨保護作用。同樣間充質(zhì)干細胞主要通過(guò)旁分泌方式參與免疫調節，所以間充質(zhì)干細胞所產(chǎn)生的外泌體是否也能夠起到相似的作用，值得進(jìn)一步研究。Li 等[37]將人臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體引入到骨關(guān)節炎的治療中，發(fā)現人臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體中包含了許多蛋白和微RNA（miRNA），它們能夠通過(guò)激活PI3K/Akt信號通路促進(jìn)巨噬細胞M2 型極化，減少TNF- 、IL-1、IL-6 等炎癥因子產(chǎn)生，增加IL-10 等抗炎因子產(chǎn)生，有效調節關(guān)節炎免疫過(guò)程，延緩骨關(guān)節炎進(jìn)展。

巨噬細胞作為一種可調節性強的免疫細胞，能夠分泌多種促炎因子和化學(xué)產(chǎn)物，在骨關(guān)節炎進(jìn)程中扮演著(zhù)重要角色。它能夠接收周?chē)h(huán)境的刺激，如局部細胞破壞、機械應力、炎癥等并做出反應，由原來(lái)的M0 型巨噬細胞極化為M1 型或M2 型。M1 型巨噬細胞可分泌多種炎癥因子如IL-1、IL-6 等，而M2 型巨噬細胞則能夠釋放IL-10等抗炎因子。盡管目前巨噬細胞極化對骨關(guān)節炎的作用相關(guān)研究較多，但也遇到了一些問(wèn)題，如M2 型巨噬細胞也會(huì )分泌少量的促炎因子[38]。為此，Ma 等[39]設計了一種人造M2 型巨噬細胞用于骨關(guān)節炎的治療，通過(guò)巨噬細胞膜包裹硫酸軟骨素模擬骨關(guān)節中M2 型巨噬細胞的作用，硫酸軟骨素與CD44、Toll 樣受體4 和細胞間黏附分子-1 作用，可減少NF- B 的核轉位及炎癥反應，同時(shí)促進(jìn)TGF- 1 表達，進(jìn)而促進(jìn)細胞分泌Ⅱ型膠原和糖蛋白，而通過(guò)巨噬細胞膜包裹的硫酸軟骨素能達到緩釋和炎癥響應釋放的效果。此外，Visser 等[40]提出利用巨噬細胞的高度活動(dòng)性，將藥物載入巨噬細胞內，通過(guò)巨噬細胞歸巢進(jìn)行藥物靶向運輸和釋放。Wayne 等[41]利用巨噬細胞攜帶siRNA，并成功地將目的siRNA 水平傳遞到周?chē)毎?，?shí)現了巨噬細胞運載、遞送藥物。雖然目前關(guān)于巨噬細胞的免疫工程治療研究更多是在腫瘤治療領(lǐng)域，但可以借鑒這種思路，將其應用于骨關(guān)節炎的巨噬細胞免疫工程治療中。

誘導多能干細胞廣泛應用于免疫工程，不僅因為它具有高度的可塑性，而且可以在關(guān)節內分化為各種免疫相關(guān)的細胞，研究者能夠較容易地對其進(jìn)行基因工程編輯，實(shí)現之前難以實(shí)現的免疫調節目標。在炎癥環(huán)境里，打亂軟骨的生物鐘會(huì )加重骨關(guān)節炎。Pferdehirt 等[42]先用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)調低誘導多能干細胞IL-1 受體的功能，然后進(jìn)行軟骨誘導形成工程化軟骨，這種軟骨能夠在暴露于炎性環(huán)境時(shí)免受IL-1 導致的軟骨降解和晝夜節律喪失破壞。

成纖維樣滑膜細胞在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節炎患者滑膜炎中的促炎作用已有許多報道，激活的成纖維樣滑膜細胞能分泌促炎因子而招募炎癥細胞，同時(shí)產(chǎn)生的細胞因子可導致血管新生并加重關(guān)節軟骨破壞[43]。雖然成纖維樣滑膜細胞在骨關(guān)節炎中的作用不如在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節炎中那樣重要，但它在骨關(guān)節炎中依然有顯著(zhù)的促炎特性，抑制成纖維樣滑膜細胞介導的滑膜炎癥，也為骨關(guān)節炎治療提供新的思路。

目前骨關(guān)節炎發(fā)病機制尚未完全闡明，治療效果不佳，主要治療藥物也只是緩解癥狀而非針對病因治療，不能逆轉或長(cháng)時(shí)間緩解疾病。免疫工程治療策略的快速發(fā)展，超越了以前抗炎藥和生物材料的簡(jiǎn)單應用，為實(shí)現骨關(guān)節炎個(gè)性化治療提供了可能。目前開(kāi)發(fā)出了多種靶向炎癥因子抑制劑，但臨床試驗效果并不理想。如果在新藥開(kāi)發(fā)過(guò)程中結合免疫工程與多種免疫調節方式，有可能突破當前的治療瓶頸。免疫工程治療策略的應用能夠增強藥物遞送靶向性，增加關(guān)節內藥物濃度，延長(cháng)藥物作用時(shí)間，同時(shí)能夠與基因治療、細胞治療等治療方式結合，穩定發(fā)揮關(guān)節炎內的免疫調節作用，為骨關(guān)節炎治療提供新的策略。雖然目前研究大多停留在臨床前階段，但十分期待骨關(guān)節炎免疫工程治療應用于臨床，改變骨關(guān)節炎治療和預后。