農桿菌介導細基江蘺繁枝變種轉化體系的建立

何藝賓，劉 杰，郝 華，彭 會*

（1.廈門海洋職業技術學院 海洋生物學院，福建 廈門 361100；
2.廈門大學海洋生物制備技術國家地方聯合工程實驗室，福建 廈門 361104）

江蘺（Gracilaria）是一種重要的大型海洋經濟藻類，其富含藻膠,是瓊脂提取的主要原料[1-2].據報道，瓊脂提煉工廠每年大約消耗72 300 t（干重）富含藻膠的植物原料，生產9 600 t 瓊脂，能夠創造大約17 300萬美元的經濟價值[3].隨著經濟的不斷發展，瓊脂的需求量逐年增加，天然產的江蘺已經無法滿足人們的需求，亟需進行大規模的江蘺人工養殖.但由于江蘺在人工養殖過程中容易出現藻種老化、藻體染病等問題，其人工大規模養殖受到嚴重阻礙[4].利用分子基因工程技術對江蘺藻種進行品種改良是解決當前江蘺人工養殖所產生問題的有效途徑之一.但目前江蘺基因工程的研究遠遠落后于其他大型海洋經濟藻類,如紫菜(Porphyra)等[5]，除Gan 等[6]利用基因槍在張氏江蘺（Gracilaria changii）中獲得lacZ基因的瞬時表達研究外，有關江蘺轉基因技術方法的報道也較為罕見.

農桿菌介導的轉化方法具有操作簡單、可轉移大片段DNA、插入基因整合拷貝數低、遺傳穩定性好、重排少和可優先整合到轉錄活性區等優點，已成為當前植物基因工程最常用的方法[7].楊澤熵等[8]利用農桿菌介導的方法在萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中表達外源酵母菌gpd1基因；
覃曉云等[9]建立了農桿菌介導地萊茵衣藻轉化體系.鑒于此，本研究以細基江蘺繁枝變種（Gracilaria tenuistipitatavar.liui Zhang et Xia）類愈傷組織為受體材料，采用桿菌介導的方法建立細基江蘺繁枝變種轉化體系，旨在為江蘺品種的遺傳改良提供參考.

1.1 實驗材料

供試材料：細基江蘺繁枝變種，采集自福建東山島杏陳鎮.

主要實驗試劑：乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）、潮霉素B、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、激動素（kinetin，KT）、2,4二氯苯氧乙酸（2,4-D）均購自Sigma公司.

1.2 細基江蘺繁枝變種類愈傷組織的誘導

步驟1：用軟毛刷去除細基江蘺繁枝變種藻體表面的沙泥等雜物[10]，并用無菌海水清洗3遍，然后置于25‰無菌海水（含200 mg·L-1卡那霉素）中培養2 d，培養條件為25 ℃，120 μmol·photons·m-2·s-1，光照周期L∕D=12∕12.

步驟2：選取步驟1 中培養的健康生長的藻體，摘取中間部位外植體4～5 cm（介于頂端和主干之間），用無菌海水清洗3 遍，將清洗后的外植體切成1～2 cm 大小，置于1.5%碘化鉀溶液中浸泡10 min，取出后用無菌海水清洗3遍，然后分別用含有不同激素組合的培養液暗培養21 d（培養溫度20 ℃）.暗培養結束后，分別觀察并統計不同實驗組的類愈傷組織誘導率.具體的激素組合包括組合1（25‰MES 培養液添加20 μmol·L-1MeJA、0.5 mg·L-1KT、2.0 mg·L-12,4-D、200 mg·L-1卡那霉素）和組合2（25‰MES培養液添加20 μmol·L-1MeJA、0.5 mg·L-1KT、1.5 mg·L-12,4-D、200 mg·L-1卡那霉素）.

1.3 農桿菌EHA105介導外源gfp基因轉化類愈傷組織

用接種環挑取農桿菌EHA105（攜帶植物雙元表達載體pMDC85-Gfp 質粒DNA）單菌落，接種于5 mL 含50 mg·L-1卡那霉素、50 mg·L-1利福平的LB 液體培養基（25‰海水配制）中，置于28 ℃，200 r·min-1條件下培養過夜.隔天按1%～2%的比例將前一天培養的菌種接種到新鮮的LB 培養基（含50 mg·L-1卡那霉素、100 μ mol·L-1AS、25‰海水配制）中，振蕩培養，進行二次活化.測定細菌培養液在600 nm 處的吸光值，當OD600為0.4～0.5時，進行6 500 r·min-1離心處理5 min，收集菌液于無菌離心管中，用等體積的25‰無菌海水（含50 mg·L-1卡那霉素、100 μmol·L-1AS）重懸.將方法1.2處理獲得的類愈傷組織接種到農桿菌重懸菌液（含50 mg·L-1卡那霉素、100 μmol·L-1AS）中，抽真空15 min，25 ℃,避光培養48 h.

培養48 h 后，將類愈傷組織置于含500 mg·L-1羧芐青霉素、200 mg·L-1卡那霉素的25‰無菌海水中浸泡30 min，然后用25‰無菌海水清洗3遍，清洗后置于熒光顯微鏡（Axio Scope A1，德國ZEISS）下觀察類愈傷組織轉化子中綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)報告基因的表達情況.

1.4 轉化子PCR鑒定

分別選取GFP 綠色熒光檢測陽性的轉化子和野生型類愈傷組織（約10 mg），置于1.5 mL Eppendorf離心管中，用手持式勻漿研磨儀迅速將類愈傷組織研磨成勻漿，加入400 μL DNA 提取液（200 m mol·L-1Tris-HCL（pH 8.0）、250 mmol·L-1NaCL、25 m mol·L-1EDTA，0.5%SDS，高壓滅菌后使用），劇烈搖動混勻后，12 000 r·min-1離心2 min，取上清液300 μL 加入到另一個1.5 mL Eppendorf 離心管中，加入等體積異丙醇，輕輕混勻后于室溫下靜置2 min，然后12 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，并室溫放置15 min，然后加入50 μL ddH2O 使沉淀完全溶解，即得到DNA 粗提液.分別取1 μL 基因組DNA 為模板，以引物GF:5′-GGA GAA GAA CTT TTC ACT GG-3′和引物GR：5′-GTT CAT CCA TGC CAT GTG TA-3′為擴增引物，用東盛生物2×Hs Taq mix進行PCR鑒定.

PCR 擴增體系（25 μL）：1 μL 模板DNA,1 μL 引物GF（10 μ mol·L-1）,1 μL 引物GR（10 μmol·L-1）,12.5 μL 2×Hs Taq mix,9.5 μL ddH2O.PCR 擴增條件：95 ℃5 min，95 ℃1 min,55 ℃45 s,72 ℃1 min,72 ℃10 min,30個循環.

2.1 細基江蘺繁枝變種類愈傷組織的誘導結果

外植體分別在2 種不同植物激素組合的培養液中暗培養21 d 后，觀察發現，2 種不同植物激素組合的培養液均能誘導出透明的類愈傷組織，且組合1 的類愈傷組織誘導率好于組合2，組合1 的類愈傷組織誘導率高達56.98%（表1），且其誘導出的類愈傷組織位于外植體頂端（圖1）.

圖1 組合1誘導獲得的細基江蘺繁枝變種類愈傷組織

表1 細基江蘺繁枝變種類愈傷組織的誘導率統計表

2.2 農桿菌EHA105介導的外源gfp基因轉化類愈傷組織

由圖2 可知,類愈傷組織與農桿菌EHA105 培養48 h 后在熒光顯微鏡中觀察發現：類愈傷組織轉化子表面可見數量不等的發綠色熒光的小斑點，即為表達gfp基因的轉基因組織，而對照組類愈傷組織中未能檢測到GFP 綠色熒光.實驗結果表明，農桿菌EHA105 介導法可實現外源gfp基因在類愈傷組織中的表達，植物雙元表達載體pMDC85-Gfp質粒DNA 表達框架如圖3所示.

圖2 轉基因類愈傷組織的GFP熒光檢測結果

圖3 植物雙元表達載體pMDC85-Gfp質粒DNA表達框架

2.3 轉化子PCR鑒定結果

隨機選取2個GFP 綠色熒光檢測陽性的轉化子進行PCR 鑒定，實驗結果表明，外源gfp基因在農桿菌EHA105的介導下成功地整合到細基江蘺繁枝變種類愈傷組織的基因組DNA中.如圖4所示，泳道1、2 為隨機選取的2 個轉化子基因組DNA PCR 產物電泳結果，2 個泳道中均出現單一的條帶，且條帶大小與gfp基因大小一致，而對照組野生型類愈傷組織基因DNA PCR產物電泳結果中未見目的條帶.

圖4 轉化子PCR鑒定結果

在高等植物的組織培養中，通常使用植物激素來誘導愈傷組織的形成并促進其生長與分化.通常只需單獨使用2,4-D就能成功地誘導出植物愈傷組織，其使用的工作濃度介于0.001～10 mg·L-1.然而在海藻組織培養中，植物激素是否能促進其生長，是長期以來在藻類學界中有爭議的問題[11].迄今為止，植物激素對細基江蘺繁枝變種愈傷組織誘導的影響尚未見報道.課題組前期的研究發現，MeJA 對細基江蘺繁枝變種外植體的生長具有促進作用，最佳使用濃度為20 μ mol·L-1.本研究中利用3種植物激素的不同組合，成功地誘導出了細基江蘺繁枝變種愈傷組織.由此可見，植物激素對江蘺類愈傷組織的誘導具有促進作用.

本研究首次報道采用農桿菌EHA105介導方法實現了外源gfp基因在江蘺類愈傷組織中的表達.農桿菌EHA105主要用于高等單子葉植物的遺傳轉化，通過與愈傷組織共培養的方式侵染愈傷組織，從而實現外源基因的遺傳轉化.因此，農桿菌EHA105能否在海水培養基中生長且具有侵染力是影響轉基因成敗的關鍵因素之一.

綜上，細基江蘺繁枝變種外植體的類愈傷組織可作為受體材料，采用農桿菌介導法可實現外源gfp基因在類愈傷組織中的表達，可為江蘺品種的遺傳改良提供參考.